Αλλαγές στην έκφραση τύπων κολλαγόνου που σχηματίζουν ινίδια στον μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα

Abstract

Purpose: Research concerning the molecular mechanisms of non-small cell lung cancer (NSCLC) development may provide biological markers for novel diagnostic and therapeutic strategies. Invasion of the extracellular matrix (ECM) is a crucial hallmark in tumor metastasis.It has been shown that the expression of collagen changes in malignancies, especially that of collagen XI. This would affect the ability of cancer cells to invade the stroma and metastasize. The a1 chain of collagen XI is transcribed from COL11A1 gene by alternative splicing in at least four different transcripts (termed A, B, C and E). The corresponding protein isoforms differ in the proteolysis of the N-terminus and potentially, in the way that mediate invasion in the extracellular matrix. The purpose of the study was the development of new quantitative methodologies for the general (total) COL11A1 and the C transcript (RT-qPCR methods for A and E transcripts have already been developed by our group previously), the quantification of all COL11A1 transcripts in Non Small Cell Lung Cancer and the investigation for the first time of their potential association with histopathological prognostic factors in lung cancer.Methods: Surgical lung samples from 23 patients with NSCLC and 6 patients without cancer (control group) were taken from the tumor site in cancer patients and healthy normal lung site in the control group. Real-time quantitative RT-PCR was performed with special primers for collagen type ΧΙ(α1). Real-time RT-qPCR methodologies for different transcriptis with dual hybridization probes were developed on the Light Cycler 1.5 platform (Roche, Germany). All COL11A1 transcripts were measured in 27 cDNA lung tissue specimens in a blinded fashion (8 control and 19 non-small cell lung cancer tissues with known histopathological data). Statistical analysis was performed with the IBM SPSS program.Results: Quantitive RT-PCR revieled that Collagen type XI(α1) was significantly upregulated in NSCLC sampled compared to the control group (p=0.004). There was a significant increase in the mRNA expression levels for Collagen type XI(α1) in early NSCLC stage I (6.7-fold increase). During the follow-up period (1.5±0.5 years), patients who died or has disease relapse had a 8.5-fold increase in Collagen type XI(α1) levels, compared to 3.5-fold increase in patients without disease progression (P=0.009). All 19 NSCLC samples were positive for the general COL11A1 transcript (range 11.2-1198.0 copies/μg total RNA, while five out of eight control samples were negative: mean values were also statistically significantly different (p<0.001). In four tumor samples (21%), no specific COL11A1 transcript was detected. Transcript C was detected in only three tumor samples. Regarding transcripts A and E, 13 out of 19 tumor samples were positive for either one (68%) and 11 for both (58%). Conclusions: The results indicate that increased expression levels of Collagen type XI(α1) in NSCLC may correlate to prognosis. No other statistically significant association of the specific transcripts with histopathological data was observed most probably due to the limited number of samples. As the number of general COL11A1 transcripts/µg exceeds the sum of A+E+C transcripts in all samples, there is opportunity for discovery and identification of other transcripts as well. Further investigation in this biomarker may have the potential to provide a biomarker in selecting patients needing more aggressive treatment approaches.

Εισαγωγή: Η έρευνα των μοριακών μηχανισμών στην ανάπτυξη του μη-μικροκυτταρικού καρκίνου πνεύμονα (ΜΜΚΠ) μπορεί να αποδώσει βιολογικούς δείκτες για νέες διαγνωστικές και θεραπευτικές στρατηγικές. Η διήθηση του εξωκυττάριου δικτύου (ΕΚΔ) είναι κρίσιμο στάδιο στην επέκταση και την μετάσταση του καρκίνου.Έχει δειχθεί ότι οι αλλαγές στην έκφραση των κολλαγόνων σε κακοήθειες, ειδικά του κολλαγόνου ΧΙ, επηρεάζοντας την ικανότητα του όγκου για διήθηση και μετάσταση. Η αλυσίδα α1 του κολλαγόνου ΧΙ ελέγχεται από το γονίδιο COL11A1, η μεταγραφή του οποίου οδηγεί σε τέσσερεις ισομορφές της αλυσίδας α1 (A,Β,C και Ε). Η αλυσίδες αυτές διαφέρουν στην πρωτεόλυση του Ν-αμινοτελικού άκρου, με τρόπο που ευνοείται η διήθηση και η μετάσταση. Σκοπός της μελέτης είναι η ανάπτυξη νέων ποσοτικών μεθοδολογιών ανάλυσης για το γενικό μετάγραφο του COL11A1 και την ισομορφή C, η ποσοτικοποίηση όλων των ισομορφών στον μη-μικροκυτταρικό καρκίνο πνεύμονα, κι η συσχέτιση για πρώτη φορά με ιστοπαθολογικούς προγνωστικούς παράγοντες στον καρκίνο του πνεύμονα. Μέθοδοι: Χειρουργικά δείγματα πνεύμονα από 23 ασθενείς με ΜΜΚΠ και 6 ασθενείς χωρίς καρκίνο, ελήφθησαν για την μελέτη της έκφρασης του κολλαγόνου ΧΙ(α1). Real-time RT-qPCR μεθοδολογίες με υβριδισμό διπλού probe αναπτύχθηκαν στην πλατφόρμα Light Cycler 1.5 (Roche, Germany). Τα μετάγραφα των ισομορφών του COL11A1 μετρήθηκαν σε cDNA από 27 δείγματα ιστού πνεύμονα (8 δείγματα ελέγχου και 19 δείγματα ιστού ΜΜΚΠ με γνωστά ιστοπαθολογικά δεδομένα). Η στατιστική ανάλυση έγινε με το πρόγραμμα IBM SPSS.Αποτελέσματα: Η ποσοτική αντίδραση RT-PCR έδειξε ότι το κολλαγόνο τύπου XI(α1) ήταν σημαντικά αυξημένο στα δείγματα του ΜΜΚΠ σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (P=0.004). Υπήρξε αύξηση της έκφρασης των επιπέδων mRNA του κολλαγόνου τύπου XI(α1) στο πρώιμο στάδιο Ι του ΜΜΚΠ. Κατά την περίοδο παρακολούθησης (1.5±0.5 έτη), οι ασθενείς που απεβίωσαν ή είχαν υποτροπή είχαν 8,5 φορές αύξηση των επιπέδων κολλαγόνου τύπου XI(α1) σε σύγκριση με 3,5 φορές αύξηση όσων είχαν επιζήσει χωρίς υποτροπή (P=0.009). Όλα τα 19 δείγματα του ΜΜΚΠ, που αναλύθηκαν για τις ισομορφές, ήταν θετικά για το γενικό μετάγραφο του COL11A1 (εύρος 11.2-1198.0 copies/μg ολικού RNΑ) ενώ 5 πό τα 8 δείγματα ελέγχου ήταν εντελώς αρνητικά. Η διαφορά των μέσων τιμών επίσης ήταν στατιστικά σημαντική (p<0.001). Σε 4 δείγματα ΜΜΚΠ (21%) δεν βρέθηκε μετάγραφο ισομορφής. Το μετάγραφο της ισομορφής C ανιχνεύθηκε μόνο σε 3 δείγματα όγκου. Όσον αναφορά τις ισομορφές A και E, 13 από τα 19 δείγματα ήταν θετικά για τουλάχιστον ένα από τα δύο (68%) και 11 και τα δύο (58%).Συμπεράσματα: Τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι η αυξημένη έκφραση του κολλαγόνου τύπου XI(α1) στον ΜΜΚΠ σχετίζεται με την πρόγνωση. Δεν προέκυψαν στατιστικά σημαντικές συσχετίσεις συγκεκριμένων μετάγραφων ισομορφών με ιστοπαθολογικά δεδομένα που παρατηρήθηκαν, λόγω του μικρού αριθμού δειγμάτων. Δεδομένου ότι ο αριθμός των μετάγραφων ανά μg του COL11A1 υπερβαίνει τον συνολικό αριθμό των μετάγραφων των ισομορφών A+E+C σε όλα τα δείγματα, υπάρχει η προοπτική ανακάλυψης και ταυτοποίησης επιπλέον ισομορφών. Ο συγκεκριμένος δείκτης ενδεχομένως να έχει αξία στην επιλογή των ασθενών που θα ωφεληθούν από παραπέρα συμπληρωματική χημειοθεραπεία.