Μελέτη της βιοαποικοδόμησης φαινολικών ενώσεων από μικροοργανισμούς

Abstract

The main objective of this study was elucidation of the biodegradation mechanism of phenolic compounds by two different photosynthetic microorganisms. More specifically, the model organism Chlamydomonas reinhardtii and a novel green microalga that was isolated from a contaminated site of the river Giofyros (city of Heraklio) were used.Through this study it was shown that the biodegradation of phenolic compounds by the green microalga Chlamydomonas reinhardtii is a bioenergetic process. In the absence of an alternative carbon source, Chlamydomonas was found to biodegrade phenol in order to obtain carbon reserves. At the same time the biodegradation of high initial concentrations of phenol proved to be an aerobic, photoregulated process. Chlamydomonas uses an aerobic pathway with a catechol intermediate implicated. The microalga was able to biodegrade phenol in the dark only when the cultures were supplied with oxygen exogenously. The presence of an alternative carbon source affected significantly the biodegradation process. The presence of carbon dioxide eliminated the ability of the microorganism to biodegrade phenol, while the presence of acetic acid assisted Chlamydomonas in the biodegradation of high initial concentrations of phenol effectively, resulting in biomass increase and alleviation of the impacts of xenobiotics on the photosynthetic apparatus of the alga. When culture growth was inhibited, phenol biodegradation pushed microalgae into a maintenance and survival mode. The determining step in the biodegradation of phenol proved to be the catechol ring cleavage. Chlamydomonas reinhardtii was found to be able to biodegrade partially a series of monosubstituted methylphenols. The relative position of the substituents in combination with the presence or absence of an alternative carbon source regulated the biodegradation percentage. Ortho and meta isomers exhibited resistance in biodegradation compared to the para isomer. Once again, the role of acetic acid as an alternative carbon source was demonstrated. Biodegradation studies of phenol by immobilized Chlamydomonas reinhardtii in calcium alginate beads showed that immobilized cells are able to biodegrade phenol as well. Photosynthetic efficiency measurements proved that the polymeric matrix protected the cells from phenol inhibitory effects. Cells remained matabolically active for a period of 15 days while only the cells immobilized at the outer surface of the beads contributed to the biodegradation process. Cell release depended on the initial concentration of the alginate solution as well as the culture conditions such as the presence or absence of phenol.In the final part of this thesis, a green microalga from the Giofyros river was isolated and studied. The presence of a pronounced extracellular matrix around the cell wall of this alga was found to play an important role in the protection of this microorganism from some inhibitors such as antibiotics and DCMU. The cells were able to grow in the presence of these inhibitors and keep the function of the photosynthetic apparatus active, compared to the microalga Chlamydomonas reinhardtii, which was significantly inhibited. Phenol was found not to have a measurable effect on the microalga from the river Giofyros due to the protective role of the extracellular matrix. This microorganism was found be able to biodegrade phenol only in the absence of an alternative carbon source from the culture medium. The main conclusion of this thesis is that the biodegradation of phenol by photosynthetic microorganisms is a bioenergetic process depending on the culture conditions and the structural and cell wall characteristics of each particular strain. Photosynthetic microorganisms act like bioenergetic machines that manage with the most profitable way their energy reserves by finding the best bioenergetic balance between growth, stress and the biodegradation of phenolic compounds.

Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκε η αποικοδόμηση φαινολικών ενώσεων από δύο φωτοσυνθετικούς μικροοργανισμούς. Πιο συγκεκριμένα χρησιμοποιήθηκε το μικροφύκος Chlamydomonas reinhardtii που αποτελεί έναν οργανισμό μοντέλο και ένα μικροφύκος που απομονώθηκε από ένα επιβαρυμένο σημείο στον ποταμό Γιόφυρο στην πόλη του Ηρακλείου.Από τα αποτελέσματα της διατριβής αποδείχθηκε πως η αποικοδόμηση των φαινολικών ενώσεων, οι οποιές μελετήθηκαν, από το μικροφύκος Chlamydomonas reinhardtii είναι μία αυστηρά βιοενεργητική διαδικασία. Σε συνθήκες έλλειψης εναλλακτικής πηγής άνθρακα το μικροφύκος βρέθηκε να αποικοδομεί τη φαινόλη κυρίως για να εξασφαλίσει αποθέματα άνθρακα, ενώ ταυτόχρονα η βιοαποικοδόμηση υψηλών αρχικών συγκεντρώσεων φαινόλης φάνηκε να είναι μία αερόβια και φωτοελεγχόμενη διαδικασία. Το μικροφύκος χρησιμοποιεί το αερόβιο μονοπάτι αποικοδόμησης με την παραγωγή ενός ενδιαμέσου κατεχόλης. Το μικροφύκος μπόρεσε να αποικοδομήσει τη φαινόλη στο σκοτάδι μόνο όταν του παρασχέθηκε εξωγενώς το απαιτούμενο οξυγόνο. Η παρουσία εναλλακτικής πηγής άνθρακα επηρέασε σημαντικά τη διαδικασία αποικοδόμησης. Η παρουσία διοξειδίου του άνθρακα ως εναλλακτική πηγή σχεδόν εξαφάνισε την ικανότητα του μικροφύκους να αποικοδομήσει τη φαινόλη ενώ αντίθετα το οξικό οξύ διετέλεσε επικουρικό ρόλο ώστε το μικροφύκος να αποικοδομήσει τη φαινόλη όταν αυτή βρισκόταν σε υψηλές συγκεντρώσεις οδηγώντας ταυτόχρονα σε αύξηση της βιομάζας και στη μείωση των επιπτώσεων της ουσίας στο φωτοσυνθετικό μηχανισμό. Η αναστολή στην ανάπτυξη που προκλήθηκε από τη φαινόλη έδειξε πως η φαινόλη ωθεί το μεταβολισμό του μικροφύκους Chlamydomonas σε κατάσταση συντηρησης. Από τα αποτελέσματα αποδείχθηκε ότι το καθοριστικό βήμα στην αποικοδόμηση της φαινόλης είναι η διάσπαση του ενδιαμέσου της κατεχόλης. Το μικροφύκος Chlamydomonas φάνηκε ικανό να αποικοδομήσει μερικώς και μονοϋποκατεστημένες μεθυλοφαινόλες. Η σχετική θέση των υποκαταστατών στον αρωματικό δακτύλιο σε συνδυασμό με την παροχή ή όχι εναλλακτικής πηγής άνθρακα καθόρισαν το ποσοστό της αποικοδόμησης. Τα ορθο και μετα ισομερή επέδειξαν μεγαλύτερη ανθεκτικότητα στην αποικοδόμηση σε σχέση με το αντίστοιχο παρα ισομερές και σε αυτή την περίπτωση αποδείχθηκε για άλλη μία φορά η σημασία της παρουσίας οξικού οξέος ως εναλλακτική πηγή άνθρακα στο μέσο καλλιέργειας. Οι μελέτες αποικοδόμησης της φαινόλης από ακινητοποιημένα κύτταρα Chlamydomonas reinhardtii σε σφαιρίδια αλγινικού ασβεστίου έδειξαν ότι τα ακινητοποιημένα κύτταρα είναι σε θέση να αποικοδομήσουν τη φαινόλη εξίσου ή περισσότερο αποτελεσματικά στις περισσότερες περιπτώσεις σε σχέση με τα ελεύθερα κύτταρα. Από τις μετρήσεις της μέγιστης φωτοσυνθετικής απόδοσης αποδείχθηκε πως η πολυμερική μήτρα προσέφερε προστασία στα κύτταρα από την επίδραση της φαινόλης. Τα κύτταρα παρέμειναν μεταβολικά ενεργά για ένα συνολικό διάστημα 15 ημερών, ενώ συνεισφορά στη διαδικασία αποικοδόμησης είχαν τα κύτταρα της εξωτερικής επιφάνειας των σφαιριδίων. Η απελευθέρωση των κυττάρων βρέθηκε να συσχετίζεται τόσο με την αρχική συγκέντρωση του αλγινικού, όσο και με το περιβάλλον στο οποίο βρίσκονταν τα ακινητοποιημένα κύτταρα.Στο τρίτο και τελευταίο μέρος μελετήθηκε ένα φωτοσυνθετικό μικροφύκος που απομονώθηκε από τον ποταμό Γιόφυρο. Το μικροφύκος αυτό φέρει μια εξωκυττάρια μήτρα που περιβάλλει το κυτταρικό τοίχωμα, η οποία λειτουργεί ως φυσικός φραγμός και το προστατεύει από μία σειρά χημικών αναστολέων που μελετήθηκαν όπως τα αντιβιοτικά και η DCMU. Το μικροφύκος εμφάνισε την ικανότητα να αναπτυχθεί σε αυτούς τους αναστολείς και ταυτόχρονα να κρατήσει ενεργή τη λειτουργία του φωτοσυνθετικού μηχανισμού του, συγκριτικά με το μικροφύκος Chlamydomonas reinhardtii το οποίο δεν είχε αυτή τη δυνατότητα. Όσο αφορά τη μελέτη απομάκρυνσης της φαινόλης, φάνηκε πως η ουσία δεν είχε ισχυρή επίδραση στο μικροφύκος από τον ποταμό Γιόφυρο εξαιτίας της προστασίας που του παρέχει η εξωκυττάρια μήτρα. Το μικροφύκος εμφάνισε ικανότητα αποικοδόμησης της φαινόλης μόνο απουσία εναλλακτικής πηγής άνθρακα από το μέσο καλλιέργειας. Βασικό συμπέρασμα της παρούσας διατριβής είναι πως η αποικοδόμηση των φαινολικών ενώσεων από τους φωτοσυνθετικούς μικροοργανισμούς είναι μία βιοενεργητική διαδικασία που εξαρτάται από τις εκάστοτε συνθήκες καλλιέργειας και τα χαρακτηριστικά του εκάστοτε οργανισμού. Οι φωτοσυνθετικοί μικροοργανισμοί λειτουργούν ως «καλοκουρδισμένες βιοενεργητικές μηχανές» που διαχειρίζονται με το βέλτιστο τρόπο τα παρεχόμενα αποθέματα ενέργειας και βρίσκουν το κατάλληλο ισοζύγιο ανάμεσα στην ανάπτυξη, το στρες και τη βιοαποικοδόμηση των ξενοβιοτικών ουσιών.