Περίληψη
Ο ρόλος του αντιγόνου στη ΧΛΛ υποδεικνύεται από τη χρήση συγκεκριμένων γονιδίων IGHV για τη δημιουργία των Β κυτταρικών υποδοχέων (B cell Receptors, BcRs) που εκφράζουν τα νεοπλασματικά κύτταρα, την προγνωστική αξία της δομής των BcR καθώς και την ύπαρξη υποσυνόλων ασθενών με σχεδόν πανομοιότυπους, στερεότυπους, BcR. Η δομική ομολογία υποδεικνύει το σημαντικό ρόλο ενός περιορισμένου εύρους παθογόνων ή δομικά σχετιζόμενων επιτόπων, στη λευχαιμογένεση. Η άμυνα έναντι παθογόνων μικροοργανισμών στηρίζεται στη συνεργική δράση πολλών μηχανισμών, ώστε να επιτευχθεί μία αποτελεσματική άνοση απάντηση. Σε αυτούς τους μηχανισμούς συμπεριλαμβάνεται και η μη ειδική διέγερση των Β λεμφοκυττάρων μέσω των υποδοχέων έμφυτης ανοσίας, κύριοι αντιπρόσωποι των οποίων οι τύπου Toll και NOD (Toll Like Receptors, TLRs, Nod Like Receptors, NLRs). Τα δεδομένα που υπάρχουν σχετικ ...
Ο ρόλος του αντιγόνου στη ΧΛΛ υποδεικνύεται από τη χρήση συγκεκριμένων γονιδίων IGHV για τη δημιουργία των Β κυτταρικών υποδοχέων (B cell Receptors, BcRs) που εκφράζουν τα νεοπλασματικά κύτταρα, την προγνωστική αξία της δομής των BcR καθώς και την ύπαρξη υποσυνόλων ασθενών με σχεδόν πανομοιότυπους, στερεότυπους, BcR. Η δομική ομολογία υποδεικνύει το σημαντικό ρόλο ενός περιορισμένου εύρους παθογόνων ή δομικά σχετιζόμενων επιτόπων, στη λευχαιμογένεση. Η άμυνα έναντι παθογόνων μικροοργανισμών στηρίζεται στη συνεργική δράση πολλών μηχανισμών, ώστε να επιτευχθεί μία αποτελεσματική άνοση απάντηση. Σε αυτούς τους μηχανισμούς συμπεριλαμβάνεται και η μη ειδική διέγερση των Β λεμφοκυττάρων μέσω των υποδοχέων έμφυτης ανοσίας, κύριοι αντιπρόσωποι των οποίων οι τύπου Toll και NOD (Toll Like Receptors, TLRs, Nod Like Receptors, NLRs). Τα δεδομένα που υπάρχουν σχετικά με την έκφραση των υποδοχέων TLR και NLR στη ΧΛΛ είναι περιορισμένα και προέρχονται από μικρές σειρές ασθενών. Στην παρούσα μελέτη πραγματοποιήσαμε μια συστηματική ανάλυση του προτύπου έκφρασης του σηματοδοτικού μονοπατιού των υποδοχέων TLR καθώς και των υποδοχέων NLR, σε μία μεγάλη σειρά 191 ασθενών με ΧΛΛ. Η ανάλυση περιελάμβανε όλους τους TLR και τους NOD1/2, προσαρμοστές, τελεστές, μόρια που εμπλέκονται σε άλλα σηματοδοτικά μονοπάτια που αλληλεπιδρούν με το μονοπάτι των TLR, καθώς και τελικά μόρια-‐στόχους. Παρατηρήθηκαν διαφορετικά πρότυπα γονιδιακής έκφρασης μεταξύ υποομάδων ασθενών με ΧΛΛ που ορίστηκαν με βάση τα μοριακά χαρακτηριστικά του BcR, όπως το ρεπερτόριο και το status μεταλλάξεων των γονιδίων IGHV και η έκφραση στερεότυπων BcR. Η μελέτη πραγματοποιήθηκε σε CD19+ Β λεμφοκύτταρα που επιλέχθηκαν αρνητικά από ολικό αίμα. Το γονιδιακό πρότυπο έκφρασης του σηματοδοτικού μονοπατιού των TLR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του RT² Profiler™ PCR Array kit (PAHS-‐018A array, SABiosciences), ενώ τα επίπεδα των mRNA μεταγράφων των υποδοχέων NOD1/2 μετρήθηκαν με τη χρήση ειδικών εκκινητών. Στο σύνολο των ασθενών, μεταξύ των υποδοχέων υψηλά επίπεδα έκφρασης παρουσίαζαν οι TLR7 και CD180, ενδιάμεσα οι TLR1, TLR6 και TLR10 και χαμηλά οι TLR2 και TLR9. Τα επίπεδα έκφρασης των TLR4 και TLR8 ήταν πολύ χαμηλά και σε πολλές περιπτώσεις μη ανιχνεύσιμα. Η έκφραση των TLR3 και TLR5 ήταν αρνητική στην πλειονότητα των περιπτώσεων. Οι NOD1/2 παρουσίαζαν υψηλά επίπεδα έκφρασης. Οι περισσότεροι προσαρμοστές (MyD88, TICAM1, TRAF6), οι τελεστές που ρυθμίζουν τη λειτουργία του μονοπατιού (UBE2N) καθώς και τα μόρια που εμπλέκονται στα άλλα σηματοδοτικά μονοπάτια των NFKB, JNK/p38, NF/IL6 και IRF καθοδικά του μονοπάτιου των TLR εμφάνιζαν υψηλά ή ενδιάμεσα επίπεδα έκφρασης, ενώ οι αναστολείς του μονοπατιού εκφραζόταν σε χαμηλά έως μηδενικά επίπεδα (TOLLIP, SIGIRR/TIR8). Η σύγκριση των περιπτώσεων που φέρουν μεταλλαγμένες αλληλουχίες IGHV (M-‐ΧΛΛ) έναντι εκείνων που φέρουν αμετάλλακτες αλληλουχίες IGHV (Α-‐ΧΛΛ) (124 και 67 περιπτώσεις, αντιστοίχως) αποκάλυψε ότι τα μόρια CD80, CD86, IL6, IFNG και TLR4 υπερεκφράζονταν, ενώ τα μόρια TLR8 και NFKBIL1 υποεκφράζονταν στην M-‐ΧΛΛ έναντι της Α-‐ΧΛΛ. Σημαντικές διαφορές παρατηρήθηκαν και κατά τη σύγκριση ασθενών που ανήκαν σε διαφορετικά στερεότυπα υποσύνολα (στερεότυπο υποσύνολο #4, IGHV4-‐34/1GKV2-‐30 BcR, στερεότυπο υποσύνολο #1, IGHV1/5/7-‐ IGKV1(D)-‐39 BcR, στερεότυπο υποσύνολο #8, IGHV4-‐39/IGKV1(D)-‐39 BcR): (i) υπερέκφραση των μορίων TLR7 και NFKBIA και υποέκφραση των μορίων CD86 και TLR4 στις περιπτώσεις του στερεότυπου υποσυνόλου #1 έναντι του στερεότυπου υποσυνόλου #4, (ii) υπερέκφραση ων μορίων TLR4 και MAP4K4 και υποέκφραση των μορίων NFKBIA και RIPK2 στις περιπτώσεις του στερεότυπου υποσυνόλου #8 έναντι του στερεότυπου υποσυνόλου #1 και (iii) υπερέκφραση του μορίου LY96 και υποέκφραση των μορίων RIPK2 και CD86 στις περιπτώσεις του στερεότυπου υποσυνόλου #8 έναντι του στερεότυπου υποσυνόλου #4. Συμπερασματικά, το πρότυπο έκφρασης των υποδοχέων TLR είναι παρόμοιο με το αντίστοιχο των ενεργοποιημένων Β λεμφοκυττάρων, ενισχύοντας την άποψη ότι τα κύτταρα της ΧΛΛ έχουν εμπειρία αντιγόνου. Επιπλέον, υπο-‐ομάδες ασθενών με ΧΛΛ που ορίζονται με βάση τα ιδιαίτερα μοριακά χαρακτηριστικά των BcR -‐ιδίως οι περιπτώσεις που φέρουν στερεότυπους BcR-‐ εμφανίζουν διαφορετικά πρότυπα έκφρασης των υποδοχέων TLR, γεγονός που υποδεικνύει ότι διαφορετικά (και ταυτόχρονα) σήματα εκτός από τα σήματα που προέρχονται από τον BcR μπορεί να επηρεάζουν τη συμπεριφορά του νεοπλασματικού κλώνου. Τα ώριμα Β λεμφοκύτταρα αναγνωρίζουν αντιγόνα ειδικά μέσω του Β κυτταρικού υποδοχέα (B cell Receptor, BcR) αλλά και μέσω των υποδοχέων έμφυτης ανοσίας, όπως οι υποδοχείς τύπου Toll (Toll Like Receptors, TLRs) και υποδοχείς τύπου NOD (NOD Like Receptors, NLRs), οι οποίοι ασκούν συν-‐διεγερτική δράση στον BcR. Φαίνεται ότι η σηματοδότηση μέσω BcR διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και ίσως στην εξέλιξη της Χρόνιας Λεμφοκυτταρικής Λευχαιμίας (ΧΛΛ). Ωστόσο, η ακριβής χρονική στιγμή, η διάρκεια και κυρίως η φύση της αντιγονικής διέγερσης είναι μέχρι και σήμερα αδιευκρίνιστα. Παρόλο που σημαντικά δεδομένα υποδεικνύουν ότι οι υποδοχείς έμφυτης ανοσίας σχετίζονται με την παθογένεια της ΧΛΛ, η λειτουργικότητα των υποδοχέων TLR και NLR δεν έχει μελετηθεί εκτενώς στη ΧΛΛ. Μελετήσαμε τη λειτουργικότητα των υποδοχέων TLR και NLR σε υποομάδες ασθενών με ΧΛΛ οι οποίες διαχωρίστηκαν με βάση το ρεπερτόριο, το status μεταλλάξεων των γονιδίων IGHV και την έκφραση στερεότυπων BcR. Για το λόγο αυτό μελετήσαμε 67 ασθενείς, με σκόπιμη υπερ-‐αντιπροσώπευση περιπτώσεων που εκφράζουν στερεότυπους υποδοχείς χαρακτηριστικούς των στερεότυπων υποσυνόλων #1 (IGHV1/5/7-‐IGKV1(D)-‐39) και #4 (IGHV4-‐34/IGKV2-‐30), τα οποία θεωρούνται υποδείγματα κακής και καλής πρόγνωσης, αντίστοιχα. Έγινε διέγερση CD19+ κυττάρων, που είχαν επιλεγεί αρνητικά από ολικό αίμα, με προσδέτες ειδικούς για όλους τους TLR/NLR που εκφράζονται στα Β λεμφοκύτταρα. Τα αποτελέσματα της διέγερσης εκτιμήθηκαν μετά από 12 ώρες με μέτρηση της έκφρασης των μορίων CD25 και CD86 (δείκτες ενεργοποιημένων Β λεμφοκυττάρων), με κυτταρομετρία ροής. Επίσης, μετρήθηκε η βιωσιμότητα των κυττάρων σε συγκεκριμένα χρονικά στιγμιότυπα (Ημέρα 3, 6, 9). Οι TLR1/2, TLR2/6, TLR9 και NOD2 απάντησαν στη διέγερση με τους ειδικούς προσδέτες στις περισσότερες περιπτώσεις που μελετήθηκαν, αν και με μεγάλη ετερογένεια. Η διέγερση του TLR7 με Imiquimod, ένα μικρό συνθετικό αντι-‐ιικό μόριο, οδήγησε σε αύξηση της έκφρασης του CD25 και/ή CD86 σε ~50% των περιπτώσεων. Αντίθετα, η loxoribine που είναι ο φυσικός προσδέτης του TLR7 δεν είχε καμία επίδραση στα Β λεμφοκύτταρα της ΧΛΛ. Παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στην απάντηση μετά από διέγερση επιλεγμένων TLR όταν μεταξύ περιπτώσεων που έφεραν μεταλλαγμένες έναντι αμετάλλακτων αλληλουχιών IGHV (M-‐ΧΛΛ vs Α-‐ΧΛΛ). Συγκεκριμένα, το ποσοστό των CD25 θετικών κυττάρων αυξήθηκε περισσότερο στην Α-‐ΧΛΛ μετά από διέγερση του TLR7 με Im. Αντίθετα, μετά από διέγερση του TLR9 με CpG, το ποσοστό των CD86 θετικών κυττάρων ήταν μεγαλύτερο στην M-‐ΧΛΛ. Ιδιαίτερα λειτουργικά πρότυπα των TLR και NOD2 παρατηρήθηκαν και στα διαφορετικά στερεότυπα υποσύνολα ασθενών. Συγκεκριμένα, μετά από διέγερση των υποδοχέων TLR9, TLR1/2, TLR2/6, και NOD2 με τους κατάλληλους προσδέτες, η έκφραση του CD86 επαγόταν ισχυρά στις περιπτώσεις του στερεότυπου υποσύνολου #4, ενώ στις περιπτώσεις του στερεότυπου υποσύνολου #1 η επαγωγή της έκφρασης ήταν χαμηλή έως μηδενική. Η διέγερση του TLR7 με Im δεν είχε καμία επίδραση στην έκφραση του CD86, αλλά οδηγούσε σε αυξημένη έκφραση του CD25 μόνο στις περιπτώσεις του στερεότυπου υποσυνόλου #1. Η μελέτη μας περιλάμβανε επίσης περιπτώσεις που ανήκαν στα στερεότυπα υποσύνολα #8 (IGHV4-‐39/IGKV1(D)-‐39, UM) και #16 (IGHV4-‐34/IGKV3-‐20, M). Παρατηρήσαμε ιδιαίτερα λειτουργικά πρότυπα ακόμα και όταν συγκρίναμε περιπτώσεις που ανήκαν σε στερεότυπα υποσύνολα με ίδιο status μεταλλάξεων των γονιδίων IGHV (στερεότυπο υποσύνολο #1 έναντι #8 και στερεότυπο υποσύνολο #4 έναντι #16), γεγονός που υποδεικνύει ότι τα ιδιαίτερα πρότυπα έκφρασης των υποδοχέων TLR είναι χαρακτηριστικά των στερεότυπων υποσυνόλων, ανεξάρτητα από τη χρήση συγκεκριμένου γονιδίου IGHV ή status μεταλλάξεων. Για να επιβεβαιώσουμε το παραπάνω συμπέρασμα, επικεντρωθήκαμε στις περιπτώσεις που χρησιμοποιούσαν το γονίδιο IGHV4-‐34 σε στερεότυπες (#4 και #16) και μη (non #4/16) αναδιατάξεις. Με αυτή την προσέγγιση παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές (p<0.05) ανάμεσα στις τρεις ομάδες ασθενών αναφορικά με την έκφραση των συνδιεγερτικών μορίων μετά από διέγερση των TLR1/2, TLR2/6, NOD2 και TLR9. Σε όλες τις παραπάνω συγκρίσεις παρατηρήθηκαν επίσης διαφορετικά ποσοστά βιωσιμότητας μετά από διέγερση συγκεκριμένων TLR και/ή NLR με τους κατάλληλους προσδέτες. Συμπερασματικά, η ανάπτυξη και εξέλιξη της ΧΛΛ πιθανόν επηρεάζεται και από σήματα που λαμβάνονται μέσω των υποδοχέων έμφυτης ανοσίας. Υποομάδες ασθενών με ΧΛΛ που ορίζονται με βάση τα ιδιαίτερα μοριακά χαρακτηριστικά των BcR εμφανίζουν διαφορετικά πρότυπα λειτουργικότητας των υποδοχέων TLR και/ή NLR. Με βάση τα παραπάνω, η βιολογική συμπεριφορά του λευχαιμικού κλώνου, που αντικατοπτρίζεται στην κλινική πορεία της νόσου, είναι αποτέλεσμα της συνεργασίας των κλωνοτυπικών BcR με συγκεκριμένους υποδοχείς έμφυτης ανοσίας που διαφέρουν κατά περίπτωση. Επιπλέον, τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης θα μπορούσε να χρησιμεύσουν για τη διάκριση ομάδων ασθενών που θα ωφελούνταν από τη θεραπεία με συγκεκριμένους προσδέτες.
περισσότερα
Περίληψη σε άλλη γλώσσα
The role of antigen in the development of CLL is underscored by the biased immunoglobulin (IG) gene repertoire expressed by the malignant clones, the prognostic implications of B-‐cell receptor (BcR) structure and the identification of subsets of patients with quasi-‐identical, stereotyped BcRs. The structural homology of BcRs implies a role for a limited set of antigens or structurally related epitopes in leukemogenesis. Antigen recognition and host defense rely on multiple mechanisms acting synergistically in order to mount an effective immune response. These include specific stimulation through the BcR and non-‐specific stimulation through innate immune receptors, of which the major classes are Toll-‐like receptors (TLRs) and Nod-‐ like Receptors (NLRs). The available data on TLR and NLR expression in CLL are limited and derive from small series ...
The role of antigen in the development of CLL is underscored by the biased immunoglobulin (IG) gene repertoire expressed by the malignant clones, the prognostic implications of B-‐cell receptor (BcR) structure and the identification of subsets of patients with quasi-‐identical, stereotyped BcRs. The structural homology of BcRs implies a role for a limited set of antigens or structurally related epitopes in leukemogenesis. Antigen recognition and host defense rely on multiple mechanisms acting synergistically in order to mount an effective immune response. These include specific stimulation through the BcR and non-‐specific stimulation through innate immune receptors, of which the major classes are Toll-‐like receptors (TLRs) and Nod-‐ like Receptors (NLRs). The available data on TLR and NLR expression in CLL are limited and derive from small series of patients. We performed a systematic gene expression profiling of the TLR signaling pathway and NLRs, in a large series of 191 patients with CLL. The analysis extended from all TLRs and NOD1/2 to adaptors, effectors, inhibitors and members of the NFKB, JNK/p38, NF/IL6, and IRF signaling pathways downstream of TLR signaling. In addition, differences in gene expression profiles were sought for among subgroups of cases defined by BcR molecular features, such as the repertoire and mutational status of the IG heavy variable (IGHV) genes or the expression of stereotyped BcRs. CD19+ B lymphocytes were negatively selected from peripheral blood samples. The gene expression profile of the TLR signalling pathway was determined by the RT² Profiler™ PCR Array kit (PAHS-‐ 018A array, SABiosciences), while NOD1/2 expression levels were determined with specific primers. At cohort level, among the receptors, high expression was recorded for TLR7 and CD180, intermediate for TLR1, TLR6 and TLR10 and low expression for TLR2 and TLR9. TLR4 and TLR8 were characterized by low to undetectable expression, with significant variations between patients, while TLR3 and TLR5 were not expressed in any case. The NOD1/2 receptors were highly expressed. The vast majority of adaptors (e.g. MyD88, TICAM1, TRAF6), effectors (UBE2N) and members of the NFKB, JNK/p38, NF/IL6, and IRF signaling pathways downstream of TLR signaling were intermediately-‐to-‐highly expressed, while the inhibitors of TLR activity were generally low-‐to-‐undetectable (TOLLIP, SIGIRR/TIR8). Further comparison in subgroups of cases carrying mutated vs. unmutated IGHV sequences (124 and 67 cases, respectively) revealed upregulation of CD80, CD86, IL6, IFNG and TLR4 and downregulation of TLR8 and NFKBIL1 in the mutated subgroup. Significant differences in gene expression profiles were also found in subgroups of cases with stereotyped receptors. Comparison of subset #4 (mutated IGHV4-‐34/1GKV2-‐30 BcR, 10 cases) vs. subset #1 (unmutated IGHV1/5/7-‐IGKV1(D)-‐39 BcR, 10 cases) vs. subset #8 (unmutated IGHV4-‐39/IGKV1(D)-‐39 BcR, 4 cases) revealed: (i) upregulation of TLR7 and NFKB1A and downregulation of CD86 and TLR4 in #1 vs #4 cases; (ii) upregulation of MAP4K4 and TLR4 and downregulation of NFKB1A and CD180 in #8 vs #1 cases; and, (iii) upregulation of LY96 and downregulation of RIPK2 and CD86 in #8 vs #4 cases. In conclusion, the TLR gene expression profile of CLL is consistent with derivation from antigen-‐experienced B cells. Significant variations were identified in different subgroups of cases defined by BcR molecular features, indicating distinctive activation patterns of the TLR signaling pathway, especially among cases assigned to subsets with stereotyped BcRs. These findings indicate that different or concomitant signals acting through receptors other than the BcR can affect the behavior of the malignant clone. Mature B cells recognize antigens through the B cell receptor (BcR) in a specific way and through innate immunity receptors, such as the Toll-‐like receptors (TLRs) and Nod-‐like receptors (NLRs), in a costimulatory manner. Signaling through the BcR appears to be a major contributing factor in CLL development and, perhaps, evolution. However, the timing, duration and, most importantly, the nature of antigenic exposures remain unclear. Although emerging data suggest that innate immunity receptors are relevant for CLL pathogenesis, the functionality of TLRs and NLRs in CLL is largely unexplored. We investigated TLR and NLR function within CLL subgroups defined by IGHV gene usage, IGHV gene mutational status, or BcR stereotypy. To this end, we studied a series of 67 patients, with an intentional bias to cases expressing stereotyped BcRs assigned to subsets #1 (IGHV1/5/7-‐IGKV1(D)-‐ 39) and #4 (IGHV4-‐34/IGKV2-‐30), which can be considered as prototypes of “unmutated/adverse prognosis” and “mutated/good prognosis” subsets, respectively. Negatively isolated CLL cells were stimulated with specific ligands for all TLRs/NLRs expressed in B cells. The functional outcome was assessed after 24 hours by flow cytometric determination of CD25 and CD86 expression as a measure of cell activation. We also measured cell viability at certain time points. At cohort level, TLR1/2, TLR2/6, TLR9 and NOD2 were responsive to stimulation with their respective ligands in most cases, yet in a heterogeneous fashion. TLR7 stimulation with Imiquimod, a small synthetic antiviral molecule, induced CD25 and/or CD86 in ~50% of cases; in contrast, loxoribine, a naturally occurring TLR7 agonist, had no effects. Markedly different qualitative responses were observed when comparing mutated vs. unmutated CLL cases, with TLR9 upregulating CD86 expression in mutated CLL cases, while TLR7 upregulating CD25 expression in unmutated CLL cases (p<0.05 for all comparisons). Different patterns of functional responses to TLR and NOD2 stimulation were also identified in subsets with stereotyped BcRs. In particular, stimulation of TLR9, TLR1/2, TLR2/6, and NOD2 with the respective ligands strongly upregulated CD86 expression in subset #4 cases, whereas the same treatment had a significantly less pronounced effect on subset #1 cases (p<0.05 for all comparisons). Opposite results were obtained after stimulation of the TLR7 with imiquimod, in that subset #1 cases exhibited stronger up-‐regulation of CD25 expression compared to subset #4 cases (p<0.05). Our study included additional cases belonging to stereotyped subsets #8 (IGHV4-‐39/IGKV1(D)-‐39, unmutated) and #16 (IGHV4-‐ 34/IGKV3-‐20, mutated). Differential, subset-‐biased profiles were also identified when limiting the comparisons to subsets with similar mutational status (i.e. subset #1 vs. #8 and subset #4 vs #16), underscoring the idea of “subset-‐biased” innate immunity responses independently of IGHV gene usage and/or mutational status. To further corroborate this concept, we focused on cases utilizing the IGHV4-‐34 gene, which were intentionally over-‐represented in the cohort. By this approach, we identified significantly (p<0.05) different responses after stimulation of TLR1/2, TLR2/6, TLR9 and NOD2 in subset #4 vs. non subset#4/16 IGHV4-‐34 cases (in terms of induction of either CD25 or CD86 or both. For all the above comparisons, we also identified differential percentages of viable cells after stimulation of certain TLRs and/or NLRs with their respective ligands. In conclusion, we demonstrate that the behavior of CLL malignant B cells can be influenced by signals triggered by innate immunity receptors. CLL patient subgroups defined by specific molecular characteristics of their clonotypic BcRs have distinct patterns of TLR/NLR function and/or TLR tolerance. These differences support the hypothesis that specific modalities of BcR/TLR collaboration and/or regulation may eventually impact on the biological behavior of the malignant clones. Additionally, they might prove relevant both for elucidating the immune mechanisms which underlie CLL development and also for defining subgroups of patients who might benefit from treatment with specific TLR ligands, already used in the clinical setting.
περισσότερα
