Ανάπτυξη μεθόδων ανίχνευσης/ποσοτικού προσδιορισμού σημειακών μεταλλάξεων/πολυμορφισμών με μοριακές τεχνικές

Abstract

Lateral flow assays are prefabricated strips of a carrier material containing dryreagents that are activated by applying the fluid sample. Lateral flow assaysare important for diagnostic purposes and are currently used for qualitative,semiquantitative and to some extent quantitative monitoring in resource-pooror non-laboratory environments.In the present thesis, we report a rapid and reliable dry-reagent dipstickmethod that enables simultaneous visual detection of mutations and singlenucleotidepolymorphisms (SNPs) associated with various diseases. Theprimer extension (PEXT) reaction was used in this approach for genotyping ofsingle-nucleotide polymorphisms. The method was applied to detectmutations associated with alpha- and beta-thalassemia, thrombophilia andWilson's disease. In addition, high-resolution melting curve analysis (HRMA)was used for the detection of mutations causing alpha-thalassemia and theresults were compared to those obtained by multi-allele dipstick assay.The procedure involves: a) Polymerase chain reaction in order to amplifyfragments of the gene(s) flanking the mutations of interest, b) multiplex primerextension reaction in presence of allele-specific primers (one pair permutation), biotin d-UTPs and DNA polymerase that lacks 3’-5’ nucleaseactivity and c) rapid visual detection of primer extension products by means ofmultiplex dry reagent dipstick assay using anti-biotin functionalized goldnanoparticles as reporters. Optimization studies of various parameters influencing the multiplexgenotyping reaction as well as the performance of the visual multiplexdetection system were performed in order to achieve the best optical allelediscrimination. For the method evaluation, clinical samples previouslycharacterized or with unknown genotype (blind samples), were analysed bythe proposed genotyping methods and the results were found to be fullyconcordant with reference methods.

Οι ταινίες ξηρών αντιδραστηρίων αποτελούν δημοφιλή μέθοδο διεξαγωγής διαγνωστικών δοκιμασιών. Αρχικά, χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση ποικιλίας αναλυτών όπως αντιγόνα ή αντισώματα, ενώ τα τελευταία χρόνια χρησιμοποιούνται και για την ανίχνευση προϊόντων ενίσχυσης νουκλεϊκών οξέων και σημειακών μεταλλάξεων και πολυμορφισμών.Στην παρούσα διδακτορική διατριβή αναπτύχθηκε ταχεία και αξιόπιστη μέθοδος για την ταυτόχρονη ανίχνευση σημειακών μεταλλάξεων και πολυμορφισμών, που σχετίζονται με διάφορες ασθένειες. Χρησιμοποιήθηκε η αντίδραση επέκτασης εκκινητή για τη διάκριση των αλληλίων σε συνδυασμό με ταινία ξηρών αντιδραστηρίων για την ανίχνευση των προϊόντων της γονοτυπικής αντίδρασης. Η μέθοδος εφαρμόστηκε στην ανίχνευση μεταλλάξεων που σχετίζονται με α και β-θαλασσαιμία, θρομβοφιλία και νόσο του Wilson. Επιπλέον, αναπτύχθηκε μέθοδος για την ανίχνευση μεταλλάξεων που προκαλούν α-θαλασσαιμία με ανάλυση καμπύλης τήξης υψηλής διακριτικής ικανότητας και πραγματοποιήθηκε συγκριτική μελέτη με τη μέθοδο γονοτύπησης με ταινία ξηρών αντιδραστηρίων.Η μέθοδος γονοτύπησης με αντίδραση επέκτασης εκκινητή και ταινία ξηρών αντιδραστηρίων περιλαμβάνει: α) αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης για την ενίσχυση τμημάτων γονιδίων που περιέχουν τις εξεταζόμενες μεταλλάξεις, β)πολλαπλή αντίδραση επέκτασης εκκινητή παρουσία αλληλοειδικών εκκινητών(ένα ζεύγος για κάθε μετάλλαξη), biotin-dUTPs και DNA πολυμεράσης με υπολειπόμενη 3΄-5΄ εξωνουκλεοτιδική δραστικότητα και γ) ανίχνευση των προϊόντων της αντίδρασης επέκτασης εκκινητή σε ταινία ξηρών αντιδραστηρίων με χρήση νανοσφαιριδίων χρυσού συζευγμένων με αντίσωμα έναντι βιοτίνης. Για την επίτευξη του καλύτερου οπτικού διαχωρισμού των αλληλομόρφων,βελτιστοποιήθηκαν τόσο οι παράμετροι της αντίδρασης επέκτασης εκκινητή όσο και οι παράμετροι της ανίχνευσης των προϊόντων με την ταινία ξηρών αντιδραστηρίων για κάθε εφαρμογή της μεθόδου. Για την αξιολόγηση των μεθόδων πολλαπλής γονοτύπησης/ανίχνευσης μεταλλάξεων σε κάθε εφαρμογή, αναλύθηκαν κλινικά δείγματα γνωστού και άγνωστου γονότυπου και τα αποτελέσματα βρέθηκαν σε πλήρη συμφωνία με μεθόδους αναφοράς.