Διερεύνηση και κλινική αξιολόγηση νέων δεικτών μεθυλίωσης του DNA στον καρκίνο, στα πλαίσια της υγρής βιοψίας

Abstract

Liquid biopsy, based on the analysis of circulating tumor cells (CTCs) and circulating tumor DNA (ctDNA), provides a non-invasive, real-time monitoring of tumor evolution and therapeutic efficacy. During the last few years, DNA methylation changes have been widely studied, as DNA methylation is considered as an early event in carcinogenesis but is also present at all stages of the disease.In the present PhD thesis, we initially evaluated the preanalytical parameters and the performance of whole genome amplification (WGA) protocols for reliable downstream DNA methylation analyses in liquid biopsy. The present study is the first to evaluate the stability of DNA methylation in plasma and sodium bisulfite (SB)-treated DNA under different storage conditions. Our results indicate that DNA methylation information is not preserved, when ctDNA extraction is performed in plasma samples stored for more than 8 months even at -70℃. On the contrary, SB-treated DNA can be safely stored for a long time at both -20℃ and -70℃, and DNA methylation analysis by real-time MSP can be safely performed in a total period of one year. Concerning the accuracy and precision of WGA of SB-treated DNA our results suggest that it is reliable since we get identical results before and after amplification using both SB-conversion kits. Furthermore, we developed and clinically validated a liquid biopsy-based assay for ESR1 methylation for the follow-up of metastatic breast cancer patients under endocrine treatment. We reported for the first time the presence of ESR1 methylation in CTCs and its high concordance with paired plasma ctDNA derived from the same patients. Moreover, according to our findings, ESR1 methylation in CTCs of hormone receptor-positive metastatic breast cancer patients was strongly associated with lack of response to everolimus/exemestane treatment. We additionally developed and clinically validated an assay for MLL3 promoter methylation as a novel circulating epigenetic biomarker in non-small cell lung cancer (NSCLC). Our data indicate for the first time that the detection of MLL3 promoter methylation in plasma-ctDNA provides important prognostic information for NSCLC patients.Finally, we evaluated the methylation status of tumor-suppressor genes in CTCs of head and neck cancer patients (HNSCC), isolated using the microfluidic-based Parsortix system. SOX17, RASSF1A and MLL3 were found to be methylated in CTCs at various percentages, confirming the presence of heterogeneity, even in CTCs isolated from the same patient.

Η «υγρή βιοψία», βασισμένη στην ανάλυση των κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων (circulating tumor cells, CTCs) και του εξωκυττάριου καρκινικού DNA (circulating tumor DNA, ctDNA) παρέχει μία μη-επεμβατική παρακολούθηση της εξέλιξης της νόσου και της αποτελεσματικότητας της θεραπείας, σε πραγματικό χρόνο. Η μελέτη της μεθυλίωσης του DNA, αποτελεί τα τελευταία χρόνια σημαντικό πεδίο έρευνας παγκοσμίως, καθώς αποτελεί πρώιμο γεγονός κατά την καρκινογένεση, αλλά λαμβάνει χώρα και σε όλα τα στάδια της νόσου. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή, αρχικά μελετήθηκαν οι προαναλυτικές παράμετροι σταθερότητας και πραγματοποιήθηκε αξιολόγηση της πιστότητας και ακρίβειας των αναλύσεων μεθυλίωσης του DNA στην υγρή βιοψία. Αποτελεί την πρώτη μελέτη αξιολόγησης της σταθερότητας της μεθυλίωσης του DNA στο πλάσμα και της μεθυλίωσης του χημικά τροποποιημένου DNA υπό διαφορετικές συνθήκες αποθήκευσης, Τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν ότι η πληροφορία της μεθυλίωσης δε διατηρείται εφόσον η απομόνωση του εξωκυττάριου καρκινικού DNA πραγματοποιηθεί από δείγματα πλάσματος συντηρημένα στους -70℃ για χρονική περίδο μεγαλύτερη των 8 μηνών. Αντίθετα, το χημικά τροποποιημένο DNA μπορεί να διατηρηθεί σε καταψύκτες και των -20℃ και των -70℃ για ένα έτος, χωρίς κανένα πρόβλημα στην ανάλυση μεθυλίωσης με real-time MSP. Αναφορικά με την ακρίβεια ενίσχυσης του χημικά επεξεργασμένου DNA, λάβαμε πανομοιότυπα αποτελέσματα πριν και μετά την αντίδραση ενίσχυσης. Εν συνεχεία, πραγματοποιήθηκε ανάπτυξη, επικύρωση και κλινική αξιολόγηση μεθοδολογίας για τη μεθυλίωση του γονιδίου ESR1, σε δείγματα CTCs και ctDNA, για την παρακολούθηση ασθενών με μεταστατικό καρκίνο μαστού που λαμβάνουν ενδοκρινή θεραπεία. Μέσω της αναπτυχθείσας μεθοδολογίας, αναφέρουμε για πρώτη φορά την ανίχνευση μεθυλίωσης του ESR1 στα CTCs και την υψηλή αντιστοιχία με τη μεθυλίωση στο ctDNA πλάσματος των ίδιων ασθενών. Επιπλέον, η μεθυλίωση του ESR1 στα CTCs ασθενών με ορμονοεξαρτώμενο καρκίνο μαστού, βρέθηκε να παρουσιάζει στατιστικά σημαντική συσχέτιση με την έλλειψη ανταπόκρισης στην ορμονοθεραπεία (everolimus/exemestane).Επιπρόσθετα, αναπτύξαμε, επικυρώσαμε και αξιολογήσαμε κλινικά μία νέα μέθοδο για τη μεθυλίωση του υποκινητή του γονιδίου MLL3. Με βάση τη μεθοδολογία αυτή, αξιολογήσαμε τη μεθυλίωση του MLL3 ως νέο επιγενετικό βιοδείκτη στο μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν για πρώτη φορά την ύπαρξης μεθυλίωσης του MLL3 και την προγνωστική αξία της ανίχνευσής της στο ctDNA από πλάσμα ασθενών με μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. Τέλος, πραγματοποιήσαμε μελέτη μεθυλίωσης ογκοκατασταλτικών γονιδίων σε CTCs απομονωμένα με το σύστημα Parsortix, από ασθενείς με πλακώδες καρκίνωμα κεφαλής και τραχήλου. Τα γονίδια SOX17, RASSF1A και MLL3 βρέθηκαν μεθυλιωμένα σε διαφορετικά ποσοστά, επιβεβαιώνοντας την ετερογένεια των CTCs.