Μηχανισμοί μεταγραφικής ρύθμισης των γονιδίων των μικρών Rho GTPασών RhoA και RhoB σε βλαστικά κύτταρα: ο ρόλος του μετασχηματίζοντα αυξητικού παράγοντα β (TGFβ)

Abstract

The aim of the present work was studying the transcriptional regulation mechanisms of the small RhoA and RhoB Rho GTPases as well as the possible role of the TGFβ signaling pathway in regulating the expression of these genes in stem cells. Small GTPases of the Rho subfamily have been implicated in many physiological and pathological processes in various cell types including embryonic stem cells, and their deregulation may lead to diseases such as cancer. In the present study we have performed a functional analysis of the promoters of the RhoA and the RhoB genes in order to identify regulatory elements that are important for their transcriptional control in normal (CGR8) and cancer (P-19) embryonic stem cells. We first showed that the mRNA levels of RhoA were significantly higher compared with the mRNA levels of RhoB in both embryonic stem cell lines as well in various cancer cell lines and this difference could be accounted for, at least in part, by differences in the activities of the corresponding promoters. A deletion analysis of the RhoA and RhoB promoters in CGR8 and P-19 cells revealed that the proximal regions of both promoters appear to contain regulatory elements that are critical for their activity. Notably, both proximal promoters contain CCAAT boxes and mutagenesis of these elements decreased significantly the activity of both promoters suggesting a coordinated regulation of the two genes by CCAAT box binding factors. Finally, we showed that both genes are subject to transcriptional autoregulation in stem cells and in the case of RhoB, this autoregulation requires the GTPase activity of the Rho proteins. TGFβ is a member of the transforming growth factor family, including Inhibins, Activin, AMH, BMPs, GDFs and Nodal. Generally, TGFs act as morphogens during embryogenesis providing positional information for axons determination. First of all, we examined the possible TGFβ induction of the RhoB gene in normal mouse stem cells which was not feasible under standard culture conditions, in the presence of LIF factor which preserve stem cell pluripotency. Concomitantly, under those conditions stem cells were not possible to differentiate by TGFβ. On the contrary, reduction of LIF allowed transcriptional induction of the RhoB gene by TGFβ, implying that LIF and TGFβ pathways act in opposing ways. Subsequently, we tried to repress TGFβ pathway in complete absence of LIF factor in order to investigate the role of TGFβ in the differentiation process. We observed that inhibition of the TGFβ pathway allowed pluripotency maintenance of the stem cells despite LIF absence, opposite to control cells that were committed to mesodermal differentiation. However, under those conditions there was no alteration in the transcriptional regulation of Rho genes. In summary, despite the difference in the levels of expression of the RhoA and RhoB genes in mouse embryonic stem cells, their promoters are regulated by common mechanisms. However, certain aspects of RhoA and RhoB regulation, especially their autoregulation, differ among normal and cancer stem cells. Furthermore, TGFβ induction of the RhoB gene was possible only in differentiation culture conditions. Although TGFβ inhibition allowed stem cell pluripotency maintenance, RhoA and RhoB gene expression was not altered. Understanding the mechanisms that control the transcription of Rho GTPases in stem cells is necessary in order to clarify their role in stem cell functions as well as in cancer cells that share many features with stem cells.

Σκοπός της διατριβής ήταν να μελετηθούν οι μηχανισμοί μεταγραφικής ρύθμισης των μικρών Rho GTPασών RhoA και RhoB καθώς και ο πιθανός ρόλος του σηματοδοτικού μονοπατιού του TGFβ στη ρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων αυτών στα βλαστικά κύτταρα. Οι μικρές Rho GTPάσες εμπλέκονται σε πολλές φυσιολογικές και παθολογικές διαδικασίες σε διάφορους κυτταρικούς τύπους μεταξύ των οποίων και τα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα. Η διαταραχή στη ρύθμισή τους μπορεί να οδηγήσει σε ασθένειες όπως ο καρκίνος. Στην παρούσα μελέτη επιχειρήθηκε μία λειτουργική ανάλυση των υποκινητών των γονιδίων RhoA και RhoB προκειμένου να εντοπιστούν ρυθμιστικά στοιχεία που είναι σημαντικά για την μεταγραφική τους ρύθμιση σε φυσιολογικά (CGR8) και καρκινικά (P-19) βλαστικά κύτταρα. Αρχικά παρατηρήθηκε ότι τα επίπεδα έκφρασης της RhoΑ είναι σημαντικά υψηλότερα από αυτά της RhoB και στις δύο εμβρυϊκές κυτταρικές σειρές όπως επίσης και σε διάφορες καρκινικές σειρές. Η διαφορά αυτή οφείλεται, έστω εν μέρει, στη διαφορά που υπάρχει στις ενεργότητες των αντίστοιχων υποκινητών. Λειτουργική ανάλυση των υποκινητών έδειξε ότι οι εγγύς περιοχές και των δύο περιέχουν ρυθμιστικά στοιχεία που είναι σημαντικά για την ενεργότητα τους. Συγκεκριμένα, και οι δύο υποκινητές περιέχουν CCAAT boxes, η μετάλλαξη των οποίων μείωσε σημαντικά την ενεργότητα τους υποδεικνύοντας μία κοινή ρύθμιση των δύο γονιδίων από παράγοντες που προσδένονται στο CCAAT box. Τέλος, βρέθηκε ότι και τα δύο γονίδια υπόκεινται σε μεταγραφική αυτορρύθμιση στα βλαστικά κύτταρα και ότι αυτή η αυτορρύθμιση απαιτεί την ενεργότητα GTPάσης των Rho πρωτεϊνών στην περίπτωση της RhoB. Ο TGFβ αποτελεί μέλος της οικογένειας των μετασχηματιστικών αυξητικών παραγόντων στην οποία ανήκουν οι Ινχιμπίνες, η Ακτιβίνη, η ΑΜΗ, οι ΒΜΡs , οι GDFs και ο παράγοντας Nodal. Γενικά, οι TGFs δρουν ως μορφογόνοι παράγοντες κατά τη διάρκεια της εμβρυογένεσης παρέχοντας πληροφορίες για τον καθορισμό των αξόνων και τη διαφοροποίηση των κυττάρων προς εξειδικευμένους κυτταρικούς τύπους. Αρχικά μελετήθηκε η πιθανότητα ενεργοποίησης του γονιδίου της RhoB από τον TGFβ στα φυσιολογικά βλαστικά κύτταρα και παρατηρήθηκε ότι αυτή δεν ήταν δυνατή υπό κανονικές συνθήκες καλλιέργειας, δηλαδή παρουσία του παράγοντα LIF ο οποίος διατηρεί τα κύτταρα πολυδύναμα. Συγχρόνως, υπό αυτές τις συνθήκες δεν ήταν δυνατή η διαφοροποίηση των βλαστικών κυττάρων από τον TGFβ. Αντίθετα, η ελάττωση του παράγοντα LIF επέτρεψε την ενεργοποίηση του γονιδίου της RhoB από τον TGFβ υποδηλώνοντας ότι το μονοπάτι του παράγοντα LIF ανταγωνίζεται αυτό του TGFβ. Ακόμα, προκειμένου να διερευνηθεί ο ρόλος του TGFβ στη διαδικασία της διαφοροποίησης των βλαστικών κυττάρων επιχειρήθηκε η καταστολή του, σε συνδυασμό με την πλήρη απουσία του LIF. Οι παρατηρήσεις οδήγησαν στο συμπέρασμα ότι η καταστολή του TGFβ επέτρεψε τη διατήρηση της πολυδύναμης κατάστασης των βλαστικών κυττάρων παρά την απουσία του LIF έναντι των καλλιεργειών ελέγχου που παρουσίασαν μεσοδερμική διαφοροποίηση. Ωστόσο, υπό αυτές τις συνθήκες δεν παρατηρήθηκε καμία μεταβολή στην έκφραση των γονιδίων της RhoA και της RhoB. Συμπερασματικά, παρά τις διαφορές στην έκφραση των γονιδίων της RhoA και της RhoB στα βλαστικά κύτταρα διαπιστώθηκε ότι οι υποκινητές τους ρυθμίζονται από κοινούς μηχανισμούς. Παρόλα αυτά, κάποιες πτυχές της ρύθμισης τους, όπως η αυτορρύθμιση, διαφέρουν ανάμεσα στα φυσιολογικά και τα καρκινικά βλαστικά κύτταρα. Είναι σημαντικό, επίσης, ότι η ενεργοποίηση του γονιδίου της RhoB από τον TGFβ είναι δυνατή μόνο σε συνθήκες που επιτρέπουν τη διαφοροποίηση. Ωστόσο, ενώ η καταστολή του TGFβ επέτρεψε τη διατήρηση της πολυδυναμίας των βλαστικών κυττάρων, δεν είχε καμία επίδραση στη ρύθμιση των Rho γονιδίων. Η κατανόηση των μηχανισμών που ελέγχουν την έκφραση των Rho GTPασών στα βλαστικά κύτταρα είναι απαραίτητη προκειμένου να αποσαφηνιστεί ο ρόλος των πρωτεϊνών αυτών στις λειτουργίες των βλαστικών αλλά και των καρκινικών κυττάρων με τα οποία μοιράζονται πολλές ομοιότητες.