Ανάπτυξη βιοτεχνολογικών διεργασιών για την τροποποίηση φυσικών και συνθετικών πολυμερών

Abstract

Synthetic fabrics occupy a great part of the textile industry production satisfying variable ordinary needs, nonetheless, their high hydrophobicity constitutes an important weakness that impedes process manufacture. The enzymatic superficial treatment of these materials is a modern and eco-friendly procedure that aims at the increase of the polymers’ hydrophilicity. Herein, the enzymatic surface hydrolysis of poly(ethylene terephthalate) (PET) fabric is succeeded using a recombinant cutinase from Fusarium oxysporum. Initially, the potential of this enzyme in PET modification was proved by its capability to hydrolyze two model substrates, bis(benzoyloxyethyl) terephthalate and commercial bis(2-hydroxyethyl) terephthalate, that mimic polyester surface. Subsequently, PET fabrics were superficially hydrolyzed using the tested cutinase as biocatalyst. The extent of the enzymatic treatment was monitored by the quantification of terephthalic acid and its derivatives released in reaction supernatant. The optimal parameters were found to be 40 oC, pH 8.0, and 1.92 mg enzyme loading per gram of fabric. Tensile test and dyeability analyses were also employed achieving a color strength K/S increase up to 150 %, confirming the successful surface modification without degrading the quality of the starting material. Τhe enzymatic surface modification of polyamide (PA) 6.6 fabric was studied with the use of the commercial protease Alcalase 2.4 L at optimal conditions as described in the data sheet provided by the company Novozymes. Initially, in order to test the potential of hydrolytic activity of Alcalase, the enzyme was successfully tested on a model substrate, bis-hexyl amide, that mimics polyamide surface, by monitoring the quantification of amino-groups released in the reaction supernatant. Subsequently, Alcalase was applied for surface modification of PA fabrics that were studied via dyeing parameters K/S and ΔE values. For treatment at 40–60 oC and pH 8.0 ΔE was found to be approximately 14 and K/S was 1.24-fold increased. The investigated enzymatic process enhanced the hydrophilicity with 2.7-fold water absorbency increase of PA textiles, while maintaining the thermal and mechanical properties of the bulk synthetic material. The controlled enzymatic hydrolysis of PET and PA textiles is further confirmed and characterized using various spectroscopic methods, such as FTIR-ATR and XPS. Furthermore, in the current PhD thesis the use of crude violacein derived from the bacterium Janthinobacterium lividum for preparing antimicrobial polyamide fabrics is investigated. The optimal culture conditions for maximum biomass and violacein production were found to be 25 oC, pH 7.0, while the addition of ampicillin of 0.2 mg mL-1 in Erlenmeyer flasks increased violacein production 1.3-fold. In scale-up trials, the addition of 1 % (v/v) glycerol in the logarithmic phase in a fed batch bioreactor, resulted in 5-fold extracted crude violacein increase with final concentration of 1.83 g/L. PΑ 6.6 fabrics were dyed following three different processes; through simultaneous fermentation and dyeing (SFD), by incubating the fabric in the sonicated bacterial culture after fermentation and finally by using cell-free methanol extract. The maximum ΔΕ and K/S obtained for ΡΑ fabrics were 74.81 and 22.01, respectively and were obtained through SFD approach. Furthermore, for SFD dyed samples, no alteration of fastness and staining of dye at acid and alkaline perspiration or at water was indicated. In order to examine the antimicrobial activity of the dyed polyamide fabrics, they were tested against cell growth of several pathogenic microorganisms. The violacein dyed fabrics presented significant antifungal activity against Candida albicans, Candida parapsilosis and Candida krusei, as well as antibacterial properties against Escherichia coli and Staphylococcus aureus and the superbug S. aureus MRSA.As far as natural polymers are concerned, acylated polysaccharides have drawn attention, since they find applications in numerous fields as biocompatible and biodegradable amphiphilic compounds. The ability of an acetic acid esterase of carbohydrate esterases family 2 (CE2) from Clostridium thermocellum to catalyze acyl transfer to glucan and manno-polysaccharides of significant interest was investigated. Initially, screening tests were conducted on aldohexose monosaccharides and disaccharides, exploiting the enzyme’s strict regioselectivity at O-6 position which was justified via NMR and ESI-MS. Modified monosaccharides acquired acylation yields from 11 up to 65 %, showing preference for small chain acyl donors, while disaccharides exhibited conversion yields from 23 up to 58 %, with preference to monoacylation. The transesterification reactions of the pre-mentioned polysaccharides were carried out, for the first time, in two-phase mixtures consisted of water/vinyl esters. Acylation of polysaccharides were confirmed by TLC and FTIR, while the degree of acylation was determined via methanolysis and quantification of the produced methyl esters with HPLC, estimating a range of acylation from 0.022 to 1.083 mmol of acyl group per g of polysaccharide, depending on the structure and composition of the target polysaccharide.

Στην παρούσα διατριβή αναπτύσσονται καινοτόμες βιοτεχνολογικές, φιλικότερες προς το περιβάλλον διεργασίες για την τροποποίηση συνθετικών και φυσικών πολυμερών, με στόχο την αναβάθμιση των ιδιοτήτων τους και τη διεύρυνση του πεδίου εφαρμογών τους.Τα συνθετικά υφάσματα αποτελούν σημαντικό κομμάτι της κλωστοϋφαντουργίας, καθώς έχουν ευρύ πεδίο εφαρμογών, ωστόσο η υψηλή υδροφοβικότητα τους αποτελεί βασική αδυναμία. Η ενζυμική επεξεργασία αυτών των πολυμερικών υλικών είναι μια σύγχρονη και φιλική προς το περιβάλλον προσέγγιση που αποσκοπεί στην αύξηση της υδροφιλικότητας. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή, η ενζυμική επιφανειακή υδρόλυση υφάσματος πολυ(τερεφθαλικού αιθυλεστέρα) (ΡΕΤ) επιτυγχάνεται με χρήση μιας ανασυνδυασμένης κουτινάσης από τον Fusarium oxysporum. Αρχικά εξετάστηκε και επιβεβαιώθηκε η υδρολυτική ικανότητα της κουτινάσης σε δύο μοντέλα υποστρώματα, τον τερεφθαλικό δις-βενζοϋλοξυαιθυλεστέρα και τον εμπορικό τερεφθαλικό 2-υδροξυαιθυλεστέρα, που προσομοιάζουν την επιφάνεια του ΡΕΤ. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε υδρόλυση πλεκτών υφασμάτων ΡΕΤ. Η υδρόλυση ποσοτικοποιήθηκε με υπολογισμό της συγκέντρωσης του τερεφθαλικού οξέος και των παραγώγων του που απελευθερώνονται στο υπερκείμενο της αντίδρασης, ενώ βρέθηκαν οι βέλτιστες συνθήκες ενζυμικής υδρόλυσης: 40 οC, pH 8.0, και 1.92 mgενζυμικού φορτίου/gυφάσματος. Ακολούθως, έλαβε χώρα μελέτη αντοχής σε εφελκυσμό και δοκιμές βαφής, όπου επιτεύχθηκε αύξηση της έντασης χρώματος K/S κατά 150 %, χωρίς να υποβαθμίζεται η ποιότητα του αρχικού υλικού. Η επιφανειακή ενζυμική υδρόλυση του πολυαμιδικού (PA) 6.6 υφάσματος έλαβε χώρα με χρήση της εμπορικής πρωτεάσης Alcalase 2.4 L σε βέλτιστες συνθήκες, όπως αυτές ορίζονται σύμφωνα με το πρωτόκολλο της εταιρίας Νovozymes. Αρχικά εξετάστηκε και επιβεβαιώθηκε η δυνατότητα ενζυμικής υδρόλυσης ενός μοντέλου υποστρώματος, του αδιπικού δις-εξυλαμιδίου, που μιμείται την πολυαμιδική επιφάνεια, με ποσοτικοποίηση των αμινομάδων που απελευθερώνονται στο υπερκείμενο της αντίδρασης. Στη συνέχεια τα τροποποιημένα ΡΑ υφάσματα μελετήθηκαν μέσω βαφής και αξιολόγησης της έντασης χρώματος K/S και διαφοράς χρώματος ΔE. Με εφαρμογή θερμοκρασιών από 40 έως 60 oC και pH 8.0 επιτεύχθηκε ΔE ίσο με 14 και 1.24-φορές αύξηση του K/S. Η ενζυμική υδρόλυση παράλληλα αύξησε την απορροφητικότητα σε νερό κατά 2.7 φορές, ενώ διατηρήθηκαν οι θερμικές και μηχανικές ιδιότητες της κύριας μάζας του συνθετικού υλικού. Η ελεγχόμενη ενζυμική τροποποίηση των PET και PA υφασμάτων εξετάστηκε και μέσω φασματοσκοπικών μεθόδων, όπως FTIR-ATR και XPS. Επιπρόσθετα, στην παρούσα διατριβή μελετήθηκε η παραγωγή της χρωστικής βιολασεΐνης από το βακτήριο Janthinobacterium lividum και η χρήση της για την βαφή πολυαμιδικών υφασμάτων, τα οποία απέκτησαν αντιμικροβιακές ιδιότητες. Οι βέλτιστες συνθήκες για μέγιστη παραγωγή βιομάζας και συνεκδοχικά βιολασεΐνης βρέθηκαν να είναι οι 25 oC, pH 7.0, ενώ η προσθήκη αμπικιλλίνης 0.2 mg/mL οδήγησε σε 1.3 φορές αύξηση της βιολασεΐνης. Σε μεγαλύτερη κλίμακα η προσθήκη 1 % (v/v) γλυκερόλης στη λογαριθμική φάση ανάπτυξης σε βιοαντιδραστήρα ημιδιαλείποντος έργου οδήγησε σε πενταπλάσια παραγωγή εκχυλισμένης ακατέργαστης βιολασεΐνης συγκέντρωσης 1.83 g/L. ΡΑ 6.6 υφάσματα βάφτηκαν μέσω τριών διεργασιών: μέσω παράλληλης ζύμωσης και βαφής του υφάσματος (SFD), μέσω επώασης του υφάσματος σε βακτηριακή καλλιέργεια μετά τη ζύμωση και ύστερα από εφαρμογή υπερήχων και τέλος με χρήση της εκχυλισμένης βιολασεΐνης από το εσωκυτταρικό. Οι μέγιστες τιμές ΔΕ και K/S που σημειώθηκαν ήταν 74.81 και 22.01, αντίστοιχα, για υφάσματα που βάφτηκαν μέσω της διεργασίας SFD. Ακόμη τα SFD βαμμένα δείγματα δεν επέδειξαν υποβάθμιση της αντοχής του χρώματος στον όξινο και αλκαλικό ιδρώτα και στο νερό. Με στόχο την μελέτη της αντιμικροβιακής ιδιότητας των βαμμένων με βιολασεΐνη υφασμάτων, εξετάστηκε η παρεμποδιστική τους δράση στην ανάπτυξη διάφορων παθογόνων μικροοργανισμών. Tα βαμμένα υφάσματα παρουσίασαν σημαντική αντιμικροβιακή δράση κατά των μυκήτων Candida albicans, Candida parapsilosis και Candida krusei, όπως επίσης και κατά των βακτηριακών στελεχών Escherichia coli και Staphylococcus aureus και του υπερβακτηρίου S. aureus MRSA.Αναφορικά με τα φυσικά πολυμερή, οι ακυλιωμένοι πολυσακχαρίτες ελκύουν το ενδιαφέρον, καθώς βρίσκουν εφαρμογή σε πολλούς τομείς ως βιοσυμβατές και βιοαποικοδομήσιμες ενώσεις. Στην παρούσα διατριβή, μελετήθηκε η δυνατότητα μιας εστεράσης του οξικού oξέος, που ανήκει στην οικογένεια υδατανθρακικών εστερασών CE2 από τον Clostridium thermocellum, να καταλύει την σύνδεση ακυλομάδων σε γλυκάνη και μαννο-πολυσακχαρίτες. Αρχικά πραγματοποιήθηκαν αντιδράσεις μετεστεροποίησης μονοσακχαριτών και δισακχαριτών αλδοεξόζων, παρουσιάζοντας ενζυμική τοποεκλεκτικότητα στη θέση O-6 των σακχάρων, όπως επιβεβαιώθηκε μέσω NMR και ESI-MS. Οι τροποποιημένοι μονοσακχαρίτες παρουσίασαν αποδόσεις ακυλίωσης από 11 έως 65 %, με προτίμηση σε ακυλοδότες βραχείας αλύσου, ενώ οι δισακχαρίτες επέδειξαν αποδόσεις από 23 έως 58 %, με προτίμηση στην μονοακυλίωση. Οι αντιδράσεις μετεστεροποίησης των εν λόγω πολυσακχαριτών έλαβαν χώρα για πρώτη φορά σε συστήματα δύο φάσεων νερού/βινυλεστέρων, καθώς, όπως διαπιστώθηκε, δεν υπάρχει αντίστοιχη αναφορά στη βιβλιογραφία. Η μετεστεροποίηση των πολυσακχαριτών επιβεβαιώθηκε με TLC και FTIR, ενώ ο βαθμός ακυλίωσης προσδιορίστηκε, ύστερα από μεθανόλυση των πολυσακχαριτών και ποσοτικοποίηση των σχηματιζόμενων μεθυλεστέρων με HPLC, από 0.022 έως 1.083 mmol ακυλομάδας ανά g πολυσακχαρίτη, ανάλογα τη δομή και την σύσταση του πολυσακχαρίτη-στόχου.