Επίδραση της χημειοθεραπείας με ή χωρίς τον αντι-αγγειογενετικό παράγοντα Bevacizumab στα ανοσοκατασταλτικά κύτταρα σε ασθενείς με μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα

Abstract

Introduction: Lung cancer (LC) is among the most frequent type of malignancies, accounting for 13% of the newly diagnosed cases worldwide in 2012. Non-small-cell lung cancer (NSCLC) represents almost 85% of the total number of LC diagnoses and can be further classified into different subtypes based on the expression of certain molecular and histological features. Cancer-related Inflammation has been identified as a hallmark of cancer. Host immune system interacts with tumor cells in a complex and paradoxical process that has been shown to consist of three phases: elimination, equilibrium and escape. During the escape phase tumor cells have acquired the ability to evade immune surveillance by establishing an immunosuppressive tumor microenvironment and begin to grow uncontrollably. A wide range of cytokines released by either tumor cells or other cells in the tumor stroma appear to disrupt the balance between the antitumor immune response and immune tolerance and play a crucial role in the development of potent immunosuppressive mechanisms by inducing immunosuppressive cells, including myeloid-derived suppressive cells (MDSCs) and regulatory T cells (Treg), in both the tumor microenvironment and the peripheral blood of cancer patients.Vascular endothelial growth factor (VEGF) is the principal mediator and key promoter of tumor angiogenesis. Recent data suggest a multifaceted inhibitory effect of VEGF on the development of a potent antitumor immune response. Mechanisms underlying the immunosuppressive capacity of VEGF have been found to include inhibition of maturation of dendritic cells, promotion of MDSCs migration and selective accumulation in tumor sites and induction of Treg proliferation and enhancement of their suppressive functionality. Taking into consideration the proposed link between VEGF and immunosuppression, it can be hypothesized that, the monoclonal antibody against VEGF, bevacizumab may be useful in reversing tumor-induced immune tolerance.There is a growing body of evidence that links MDSC-, Treg- and VEGF-induced immunosuppression to tumor development and progression. Accumulating data suggest that the presence of these cells in the peripheral blood and in the tumor microenvironment is significantly associated with the patients’ clinical outcome and survival. However, there is no consensus on the phenotypic and functional characterization of these cells in NSCLC patients. Furthermore, there are limited data regarding the effect of first-line chemotherapy, with or without anti-VEGF therapy, on the frequency and functionality of these cells in patients with NSCLC. The aim of this study was to identify, phenotypically and functionally characterize subpopulations of MDSCs and Treg in the peripheral blood of NSCLC patients, determine their frequency at diagnosis and evaluate their prognostic significance. Additionally, the methodology developed allowed the study of the effect of chemotherapy, with or without the addition of bevacizumab, on the functionality and the levels of circulating immunosuppressive cells (Treg/MDSCs) and the correlation of their changes with the clinical outcome. Patients and methods: Peripheral blood was collected from newly diagnosed, treatment-naïve patients with stage IIIB/IV NSCLC before initiation of treatment, after the 3rd cycle of chemotherapy, as well as at the time of disease progression. Blood samples from aged- and sex-matched healthy volunteers were used as normal controls. Various subpopulations of MDSCs and Treg were identified and analyzed using flow cytometry. Their immunosuppressive activity was assessed by demonstrating their inhibitory effect on IFN-γ production by activated T-cells. Results: Phenotypic characterization of MDSCs subpopulations with clinical significance and their prognostic role in treatment-naïve patients with NSCLC: A total of 110 patients were enrolled in this study. The patients’ median age was 68 years. Approximately, 84.5% were men, 51.8% had adenocarcinoma and 74.5% had stage IV disease. Briefly, three new subpopulations of MDSCs were identified in patients with NSCLC: two monocytic [CD14+CD15−CD11b+CD33+HLA-DR−Lin− (CD15−M-MDSCs) and CD14+CD15+CD11b+CD33+HLA-DR−Lin− (CD15+ M-MDSCs)] and one granulocytic [CD14−CD15+CD11b+CD33+HLA-DR−Lin− (G-MDSCs)]. The levels of these MDSCs subpopulations were significantly increased in the peripheral blood of the patients compared to healthy donors [(CD15+ M-MDSCs, 3.5 ± 0.5% versus 0.5 ± 0.2%, p≤0.0001), (CD15− M-MDSCs, 5.2 ± 0.5% versus 3 ± 0.8%, p=0.04) and (G-MDSCs, 2 ± 0.5% versus 0.1 ± 0.02%, p≤ 0.0001)]. However, the difference in the frequency of these subpopulations among patients with stage III disease and those with stage IV disease was not statistically significant. Patients who progressed after 3 cycles of treatment had higher M-MDSCs levels prior to initiation of treatment (CD14+CD15+HLA-DR−Lin−: 1.1 ± 0.3% and CD14+CD15−HLA-DR−Lin−: 5.5 ± 1.1%) compared to those with disease control (CR, PR and SD) (0.6 ± 0.07%, p=0.02 and 2.9 ± 0.3%, p=0.02, respectively). Moreover, MDSCs’ percentage within the “normal range” (levels within the 90% of the healthy controls) prior to initiation of therapy was associated with a longer progression-free survival (PFS) and overall survival (OS) compared to increased (>90% of the healthy controls) MDSCs’ levels (10.87 versus 5.3 months, p=0.005 and 12.9 versus 7.1 months, p=0.008, respectively). In the multivariate analysis, increased frequency of circulating CD15+ Μ-MDSCs before treatment initiation was identified as an independent prognostic factor for poor survival (PFS: HR = 2.41, 95% CI: 1.37–4.24, p=0.002 and OS: HR = 2.35, 95% CI: 1.25–4.41, p=0.008). Finally, it was demonstrated that these MDSCs subpopulations are functional and suppress the production of IFN-γ by activated CD3+ T cells. Effect of treatment on the MDSCs’ subpopulations in the peripheral blood of patients with NSCLC: A total of 46 patients were included, 33 on the chemotherapy arm and 13 on the chemotherapy plus bevacizumab arm. The patients’ median age was 68 and 85% were male. After 3 cycles of treatment, 24% of the patients experienced PR, 67% SD and 9% PD.Overall, chemotherapy did not appear to have a uniform or significant impact on the levels or the functionality of the various subpopulations of circulating MDSCs. However, three cycles of bevacizumab-based chemotherapy resulted in a statistically significant decrease in the levels of the G-MDSCs subpopulation compared to regimens that did not include bevacizumab (mean change in percentages of G-MDSCs with the bevacizumab-based versus non–bevacizumab-based regimens: –0.68% ± 0.34% versus 0.69% ± 0.38%, p=0.0086). Furthermore, after 3 cycles of treatment, patients experiencing PD had significantly increased levels of all three MDSCs subpopulations compared to the levels in patients that responded (CR+PR+SD) to treatment. Interestingly, patients with PD had a statistically significant increase in the percentage of CD15+ M-MDSCs compared to the pre-treatment levels (p=0.03). Phenotypic characterization of Treg subpopulations with clinical significance and their prognostic role in treatment-naïve patients with NSCLC: A total of 156 patients with NSCLC were enrolled in this study. The patients’ median age was 62 years, 82.1% were male, 57.6% had adenocarcinoma and 82.1% had stage IV disease.Briefly, the levels of CD4+CD25+ Treg were significantly increased in the peripheral blood of the patients compared to healthy donors (24.81 ± 1% versus 14.67 ± 1.5%, respectively, p= 0.0002). Depending on the stage of activation and differentiation, three CD4+ Treg subtypes were further analyzed: naive, effector and terminal effector Treg. Patients with PD as best response to first line treatment had increased percentage of naive Treg (CD25highCD127-/lowCD152-FoxP3lowCD45RO–) prior to treatment initiation compared to those with disease control (CR, PR and SD) (3.17 ± 0.58% versus 0.81 ± 0.33%, respectively, p=0.003). Moreover, increased (>90% of the healthy controls) levels of naïve Treg at baseline were associated with significantly shorter OS compared to that of patients with Treg percentage within the normal range (levels within the 90% of the healthy controls) (OS: 18.37 versus 40.47 months, respectively, p=0.039). Similarly, patients with increased levels of effector Treg(CD25highCD127lowCD152+FoxP3+CD45RO+) before treatment initiation had significantly shorter PFS (6.8 versus 8.53 months, p=0.046) and OS (5 versus 15.37 months, p=0.037) relative to that of patients with Treg levels within the normal range. In contrast, patients experiencing PD had significantly lower levels of terminal effector Treg (CD25highCD127-CD152+FoxP3+CD45RO+) at baseline compared to those with disease control (PD versus CR+PR+SD: 7.48 ± 1.27% versus 14.08 ± 2.74%, respectively, p=0.04). Moreover, increased levels of terminal effector Treg were associated with longer PFS (16.2 versus 7.5 months respectively, p=0.03) and OS (undefined versus 12.63 months, respectively, p=0.049). Multivariate analysis revealed that increased frequency of circulating naive Treg at baseline is an independent prognostic factor for poor OS (HR = 8.632, 95% CI: 2.226-33.468, p=0.002). Finally, it was found that, all the above described, Treg subpopulations, regardless of their activation and differentiation stage, are functional and suppress the production of IFN-γ by activated CD4+ T cells. Effect of treatment on the Treg subtypes in the peripheral blood of patients with NSCLC: A total of 46 patients were included in this study, the same patients analyzed for the effect of treatment on MDSCs. Blood samples were obtained before initiation of first-line therapy and after 3 cycles of treatment. Overall, chemotherapy was not associated with a significant change in the levels of the CD4+CD25highCD127−CD152+FoxP3+ Treg, in the peripheral blood of the patients. However, after three cycles of bevacizumab-based chemotherapy, patients receiving bevacizumab had statistically significant decreased levels of CD4+CD25highCD127−CD152+FoxP3+ Treg compared to patients who did not receive bevacizumab (percentages after 3 cycles of treatment with bevacizumab-based versus non-bevacizumab-based regimens: 14.81 ± 4.615% versus 36.44 ± 4.506%, p=0.0058). In particular, regarding naive Treg, patients who received 3 cycles of bevacizumab-based treatment had statistically significantly lower cell counts compared to patients who did not receive bevacizumab (naive Treg percetnage after 3 cycles of treatment, bevacizumab versus non-bevacizumab based treatment: 0.6273 ± 0.345% versus 3.44 ± 1.076%, p=0.019). In contrast, non-bevacizumab based chemotherapy was associated with a statistically significant increase in the naive Treg levels in the peripheral blood of the patients (naive Treg pre- and after 3 cycles of treatment without bevacizumab: 1.456 ± 0.353% versus 3.44 ± 1.076% respectively, p=0.045). There was no statistically significant difference in the levels of effector Treg between patients treated with or without the addition of bevacizumab (mean change in effector Treg percentage, bevacizumab based versus non-bevacizumab based regimens: 0.3818 ± 1.54% versus -1.59 ± 3.2%, p=0.49). Finally, after 3 cycles of treatment, patients treated with bevacizumab had decreased levels of terminal effector Treg compared to patients who did not receive bevacizumab (terminal effector Treg percentage after 3 cycles of treatment, bevacizumab based versus non-bevacizumab regimens: 7.3 ± 2.958% versus 15.72 ± 3.128%, p=0.059). Conclusions: In conclusion, this study precisely defines, phenotypically and functionally, distinct MDSCs and Treg subpopulations with prognostic significance in the peripheral blood of patients with NSCLC. Quantification of their frequency in the peripheral blood has emerged as an independent prognostic factor for survival in patients with NSCLC, highlighting the potential clinical utility of the particular biomarker. The selective targeting of specific MDSCs and Treg subpopulations through bevacizumab-based treatment provides evidence for the immunomodulating effect of anti-angiogenic therapy and bevacizumab emerges as a promising agent in “taking the foot off the brake of immunosuppression”. Nevertheless, these experimental and clinical findings remain to be confirmed prospectively in future randomized clinical trials enrolling more patients with more homogeneity in the histological type, the disease burden and the treatment that they receive. At the same time, efforts should be mounted toward linking the levels of the circulating MDSCs and Treg with their frequency in the tumor microenvironment, where they exert their immunosuppressive action. Improving the understanding of the biology and the functionality of MDSCs and Treg is considered to be of paramount importance for the development of novel strategies to efficiently detect, quantify and, finally, target tumor-induced immunosuppression.

Εισαγωγή: Ο καρκίνος του πνεύμονα είναι μία από τις συχνότερες νεοπλασίες, αντιπροσωπεύοντας το 13% των νέων διαγνώσεων καρκίνου παγκοσμίως κατά το έτος 2012. Ο ΜΜΚΠ είναι ο πιο συχνός τύπος καρκίνου του πνεύμονα (~85% των περιπτώσεων) και διακρίνεται περαιτέρω σε διάφορους υπότυπους (αδενοκαρκίνωμα, πλακώδες καρκίνωμα, κτλ) με βάση μοριακά και ιστολογικά χαρακτηριστικά. Ο κεντρικός ρόλος της φλεγμονώδους διαδικασίας και των κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος κατά την καρκινογένεση έχει σε σημαντικό βαθμό ήδη αποδειχθεί. Το ανοσοποιητικό σύστημα του ξενιστή αλληλεπιδρά με τα καρκινικά κύτταρα μέσω μίας παράδοξης διαδικασίας που μπορεί να διακριθεί σε τρία στάδια: 1) το στάδιο της εξάλλειψης (elimination), 2) το στάδιο της ισορροπίας/ανοσοελέγχου (equilibrium) και 3) το στάδιο της ανοσοδιαφυγής (escape), όπου τα νεοπλασματικά κύτταρα εγκαθιστώντας ένα ανοσοκατασταλτικό μικροπεριβάλλον διαφεύγουν της ανοσολογικής επιτήρησης και πολλαπλασιάζονται πλέον ανεξέλεγκτα. Μεταξύ των ισχυρότερων αναστολέων της αντινεοπλασματικής ανοσολογικής απάντησης είναι τα Τ-ρυθμιστικά κύτταρα (Treg) και τα άωρα μυελοειδή κατασταλτικά κύτταρα (MDSCs). Ωστόσο, τα δεδομένα που υπάρχουν για το ρόλο των MDSCs και των Treg σε ασθενείς με ΜΜΚΠ είναι περιορισμένα.Ο VEGF είναι ο ισχυρότερος ρυθμιστής της νέο-αγγειογένεσης. Πρόσφατα δεδομένα υποστηρίζουν μία πολύπλευρη και ισχυρή κατασταλτική επίδραση του VEGF στην αντινεοπλασματική ανοσολογική απάντηση. Μεταξύ των προτεινόμενων μηχανισμών περιλαμβάνονται η αναστολή της ωρίμανσης των δενδριτικών κυττάρων, η προσέλκυση MDSCs στην περιοχή του όγκου και η προαγωγή του πολλαπλασιασμού των Treg. Λαμβάνοντας υπόψη την προτεινόμενη σχέση ανάμεσα στο VEGF και την ανοσοκαταστολή , το bevacizumab (μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι του VEGF) μπορεί να έχει έναν ισχυρό ρόλο στην αναστροφή του «μικροπεριβάλλοντος ανοσολογικής ανοχής» που δημιουργεί ο καρκίνος.Με βάση τα προαναφερθέντα, γίνεται αντιληπτό ότι ένα ευρύ δίκτυο επικοινωνίας μεταξύ καρκινικών και ανοσοκατασταλτικών κυττάρων συμμετέχει και, πιθανώς, συνεισφέρει στην εξέλιξη της νεοπλασματικής νόσου. Τον ρόλο του διαμεσολαβητή σε αυτή την αλληλεπίδραση έχουν ποικίλες ουσίες, συμπεριλαμβανομένου και του VEGF, με τελικό στόχο την εγκατάσταση ενός συστήματος ανοσοδιαφυγής στον περιβάλλον του όγκου, που επιτρέπει τον απρόσκοπτο πολλαπλασιασμό των νεοπλασματικών κυττάρων. Η μελέτη του μηχανισμού επέκτασης, μετανάστευσης και τελικά εγκατάστασης των κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος στην περιοχή του όγκου, η αναγνώριση και ο καθορισμός συγκεκριμένων υποπληθυσμών τους με σημαντική συμμετοχή στην ανοσολογική απάντηση και ο ενδελεχής προσδιορισμός της λειτουργικότητάς τους θα αποκαλύψει δυνητικά κομβικούς θεραπευτικούς στόχους έναντι της ογκο-επαγόμενης ανοσοκαταστολής. Σκοπός: Η παρούσα ερευνητική εργασία σχεδιάστηκε με στόχο την ανίχνευση και το φαινοτυπικό χαρακτηρισμό υποπληθυσμών ανοσοκατασταλτικών κυττάρων (Treg/MDSCs) στο περιφερικό αίμα ασθενών με ΜΜΚΠ, τον προσδιορισμό της συχνότητάς τους κατά τη διάγνωση και την αξιολόγηση της προγνωστικής τους αξίας. Κατόπιν, η μεθοδολογία που αναπτύχθηκε επέτρεψε τη μελέτη της επίδρασης της χημειοθεραπείας, με ή χωρίς την προσθήκη του bevacizumab, στη λειτουργικότητα και τα επίπεδα των κυκλοφορούντων ανοσοκατασταλτικών κυττάρων (Treg/MDSCs) και τη συσχέτιση των μεταβολών τους με την κλινική έκβαση. Ασθενείς και μέθοδοι: Στη μελέτη εντάχθηκαν νεοδιαγνωσθέντες ασθενείς με ΜΜΚΠ σταδίου IIIB/IV. Περιφερικό αίμα συλλέχθηκε από τους ασθενείς πριν από την έναρξη της θεραπείας, μετά το 3ο κύκλο της θεραπείας, καθώς και τη στιγμή που διαπιστώθηκε πρόοδος νόσου. Παρόμοιας ηλικίας και φύλου, υγιείς αιμοδότες χρησιμοποιήθηκαν ως φυσιολογικοί μάρτυρες. Διάφοροι υποπληθυσμοί MDSCs και Treg μελετήθηκαν μετά από σήμανσή τους με τα κατάλληλα αντισώματα και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής. Η ανοσοκατασταλτική τους δράση εκτιμήθηκε μέσω της ανασταλτικής τους επίδρασης στην παραγωγή IFN-γ από ενεργοποιημένα Τ-κύτταρα. Αποτελέσματα: Φαινοτυπικός προσδιορισμός υποτύπων MDSCs με κλινική σημασία στο ΜΜΚΠ και ο προγνωστικός τους ρόλος: Στη μελέτη εντάχθηκαν 110 ασθενείς. Η μέση ηλικία των ασθενών ήταν 68 έτη. Στην πλειοψηφία τους ήταν άρρενες (84.5%). Το 51.8% είχαν αδενοκαρκίνωμα και το 74.5 % είχαν νόσο σταδίου IV. Δείγματα αίματος από 19 υγιείς αιμοδότες χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες (controls).Για το φαινοτυπικό χαρακτηρισμό των MDSCs χρησιμοποιήθηκαν συνολικά 11 δείκτες. Συνοπτικά, τρεις νέοι υποπληθυσμοί MDSCs ταυτοποιήθηκαν στους ασθενείς με ΜΜΚΠ, δυο μονοκυτταρικής [CD14+CD15−CD11b+CD33+HLA-DR−Lin− (CD15−M-MDSCs) και ο CD14+CD15+CD11b+CD33+HLA-DR−Lin− (CD15+ M-MDSCs)] και ένας κοκκιοκυτταρικής προέλευσης [CD14−CD15+CD11b+CD33+HLA-DR−Lin− (G-MDSCs)]. Αυτοί οι πληθυσμοί ήταν αυξημένοι στο περιφερικό αίμα των ασθενών συγκριτικά με τους φυσιολογικούς αιμοδότες [(CD15+ M-MDSCs, 3.5 ± 0.5% έναντι 0.5 ± 0.2%, p≤0.0001), (CD15− M-MDSCs, 5.2 ± 0.5% έναντι 3 ± 0.8%, p=0.04) και (G-MDSCs, 2 ± 0.5% έναντι 0.1 ± 0.02%, p≤0.0001)]. Εντούτοις, η διαφορά στη συχνότητα των MDSCs μεταξύ των ασθενών με νόσο σταδίου ΙΙΙ και εκείνων με νόσο σταδίου IV δεν ήταν στατιστικά σημαντική. Με βάση την καλύτερη ανταπόκριση στη θεραπεία, οι ασθενείς που εμφάνισαν πρόοδο νόσου (PD) είχαν υψηλότερα επίπεδα Μ-MDSCs προ της έναρξης της θεραπείας (CD14+CD15+HLA-DR−Lin−: 1.1 ± 0.3%, CD14+CD15−HLA-DR−Lin−: 5.5 ± 1.1%) συγκριτικά με τους ασθενείς που ανταποκρίθηκαν (CR, PR και SD) στην θεραπεία (0.6 ± 0.07%, p=0.02 και 2.9 ± 0.3%, p=0.02 αντίστοιχα). «Φυσιολογικά» επίπεδα των CD15+ Μ-MDSCs (εντός του 90% των επίπεδων των φυσιολογικών αιμοδοτών) προ της έναρξης της θεραπείας συσχετίσθηκαν με μεγαλύτερο διάστημα επιβίωσης χωρίς πρόοδο νόσου (PFS) και μεγαλύτερη συνολική επιβίωση (OS), συγκριτικά με τα αυξημένα επίπεδα (10.87 έναντι 5.3 μήνες, p=0.005 και 12.9 έναντι 7.1 μήνες, p=0.008, αντίστοιχα). Στην πολυπαραγοντική ανάλυση διακύμανσης της επιβίωσης, τα υψηλά επίπεδα CD15+ Μ-MDSCs προ της έναρξης της θεραπείας ήταν ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας πτωχής επιβίωσης (για το PFS: HR = 2.41, 95% CI: 1.37–4.24, p=0.002 και για το OS: HR = 2.35, 95% CI: 1.25–4.41, p=0.008). Τέλος, επιβεβαιώθηκε ότι αυτοί οι υποπληθυσμοί MDSCs είναι λειτουργικοί και καταστέλλουν την παραγωγή IFN-γ από ενεργοποιημένα CD3+ T κύτταρα. Επίδραση της θεραπείας στα επίπεδα των MDSCs στο περιφερικό αίμα των ασθενών με ΜΜΚΠ: Στην ανάλυση αυτή εντάχθηκαν συνολικά 46 ασθενείς, 33 στο σκέλος της χημειοθεραπείας και 13 στο σκέλος της χημειοθεραπείας με bevacizumab. Η μέση ηλικία των ασθενών ήταν 68 έτη. Στην πλειοψηφία τους ήταν άνδρες (85%). Μετά από 3 κύκλους χημειοθεραπείας το 24% των ασθενών εμφάνισε PR, το 67% SD και τέλος το 9% PD. Συνολικά, η χημειοθεραπεία δεν είχε κάποια ομοιόμορφη, καθολική επίδραση στον αριθμό των διαφόρων μονοκυτταρικών (M-) και κοκκιοκυτταρικών (G-) υποπληθυσμών MDSCs στο περιφερικό αίμα των ασθενών με ΜΜΚΠ. Εντούτοις, τρεις κύκλοι χημειοθεραπείας σε συνδυασμό με bevacizumab οδήγησαν σε στατιστικά σημαντική μείωση του αριθμού των G-MDSCs συγκριτικά με τα σχήματα που δεν περιελάμβαναν bevacizumab (μέση μεταβολή στη συχνότητα των G-MDSCs, θεραπεία με bevacizumab έναντι θεραπείας χωρίς bevacizumab: -0.68±0.34% έναντι 0.69±0.38%, αντίστοιχα, p=0.0086). Επίσης, μετά από τρεις κύκλους θεραπείας οι ασθενείς που εμφάνισαν PD είχαν αυξημένα επίπεδα όλων των υποπληθυσμών των MDSCs συγκριτικά με τους ασθενείς που ανταποκρίθηκαν στη θεραπεία. Μία άλλη ενδιαφέρουσα παρατήρηση από τη μελέτη αυτή ήταν ότι, μετά από 3 κύκλους θεραπείας, οι ασθενείς που παρουσίασαν PD είχαν στατιστικά σημαντική αύξηση των επιπέδων των CD15+ M-MDSCs, σε σχέση με τα επίπεδα προ της έναρξης της θεραπείας (p=0.03). Τέλος, η θεραπεία δεν επηρέασε την ανοσοκατασταλτική λειτουργία των κυττάρων. Φαινοτυπικός προσδιορισμός Treg με κλινική σημασία στο ΜΜΚΠ και ο προγνωστικός τους ρόλος: Στη μελέτη αυτή αναλύθηκαν δείγματα περιφερικού αίματος από 156 ασθενείς με ΜΜΚΠ. Η μέση ηλικία των ασθενών ήταν 62 έτη και στην πλειοψηφία τους ήταν άρρενες (82.1%). Το 57.6% είχαν αδενοκαρκίνωμα και το 82.1% είχαν νόσο σταδίου IV. Δείγματα αίματος από 31 υγιείς αιμοδότες χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες (controls).Για το φαινοτυπικό χαρακτηρισμό των Treg χρησιμοποιήθηκαν συνολικά 9 δείκτες. Τα επίπεδα των CD4+CD25+ Treg στο περιφερικό αίμα των ασθενών ήταν αυξημένα συγκριτικά με τους φυσιολογικούς δότες (24.81 ± 1% έναντι 14.67 ± 1.5%, αντίστοιχα, p=0.0002). Ανάλογα με το στάδιο ενεργοποίησης και διαφοροποίησής τους, τρεις υπότυποι των CD4+ Treg (naive, effector και terminal effectors) μελετήθηκαν. Ασθενείς με PD, ως καλύτερη ανταπόκριση στη θεραπεία πρώτης γραμμής, είχαν στατιστικά σημαντικά αυξημένη συχνότητα naive Treg (CD25highCD127–/lowCD152–FoxP3lowCD45RO–) συγκριτικά με τους ασθενείς που ανταποκρίθηκαν (CR, PR και SD) στη θεραπεία (3.17 ± 0.58% έναντι 0.81 ± 0.33%, αντίστοιχα, p=0.003). Επιπλέον, τα αυξημένα (άνω του 90% των επίπεδων στους φυσιολογικούς αιμοδότες) επίπεδα των naive CD4+Treg προς της έναρξης της θεραπείας συσχετίστηκαν με πτωχότερη OS συγκριτικά με τους ασθενείς στους οποίους τα επίπεδα των κυττάρων ήταν εντός των φυσιολογικών ορίων (OS: 18.37 έναντι 40.47 μήνες, αντίστοιχα, p=0.039). Oι ασθενείς με υψηλά επίπεδα των effector CD4+ Treg (CD25highCD127lowCD152+FoxP3+CD45RO+) προ της έναρξης της θεραπείας είχαν μικρότερο PFS (6.8 έναντι 8.53 μήνες, p=0.046) και OS (5 έναντι 15.37 μήνες, p=0.037). Αντιθέτως, ασθενείς με PD, ως καλύτερη ανταπόκριση στη θεραπεία, είχαν στατιστικά σημαντικά χαμηλότερα ποσοστά terminal effector Treg (CD25highCD127–CD152+FoxP3+CD45RO+) (PD έναντι CR+PR+SD: 7.48 ± 1.27% έναντι 14.08 ± 2.74%, αντίστοιχα, p=0.04). Μάλιστα, υψηλά επίπεδα των terminal effector Treg, προ της έναρξης της θεραπείας, συσχετίσθηκαν με αυξημένο PFS (16.2 έναντι 7.5 μήνες αντίστοιχα, p=0.03) και OS (μη προσδιορισμένη έναντι 12.63 μήνες, αντίστοιχα, p=0.049). Στην πολυπαραγοντική ανάλυση διακύμανσης της επιβίωσης η υψηλή συχνότητα των naïve Tregs στο περιφερικό αίμα ασθενών με ΜΜΚΠ ήταν ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας πτωχής OS (HR= 8.632, 95% CI: 2.226-33.468, p=0.002). Τέλος, διαπιστώθηκε ότι οι συγκεκριμένοι υποπληθυσμοί Treg, ανεξάρτητα από το στάδιο ενεργοποίησης τους και διαφοροποίησης τους, είναι λειτουργικοί και καταστέλλουν την παραγωγή IFN-γ από ενεργοποιημένα CD4+ T κύτταρα. Επίδραση της θεραπείας στα επίπεδα των Treg υποτύπων στο περιφερικό αίμα ασθενών με ΜΜΚΠ: Συνολικά αναλύθηκαν 46 ασθενείς με ΜΜΚΠ, οι ίδιοι ασθενείς που αναλύθηκαν για την επίδραση της θεραπείας στα MDSCs. Από αυτούς ελήφθη αίμα προ της χορήγησης και μετά από 3 κύκλους θεραπείας.Συνολικά, η θεραπεία δεν οδήγησε σε στατιστικά σημαντική μεταβολή των επιπέδων των CD4+CD25highCD127−CD152+FoxP3+ Treg στο περιφερικό αίμα των ασθενών. Ωστόσο, μετά από 3 κύκλους θεραπείας οι ασθενείς που έλαβαν bevacizumab είχαν στατιστικά σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα CD4+CD25highCD127−CD152+FoxP3+ Treg συγκριτικά με τους ασθενείς που δεν έλαβαν bevacizumab (ποσοστά μετά από 3 κύκλους θεραπείας, θεραπεία με bevacizumab έναντι θεραπείας χωρίς bevacizumab: 14.81 ± 4.615% έναντι 36.44 ± 4.506%, p=0.0058). Ειδικότερα για τα naive Treg, μετά από 3 κύκλους θεραπείας, οι ασθενείς που είχαν λάβει bevacizumab είχαν στατιστικά σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα κυττάρων συγκριτικά με τους ασθενείς που δεν έλαβαν bevacizumab (ποσοστά naive Treg μετά από 3 κύκλους θεραπείας, θεραπεία με bevacizumab έναντι θεραπείας χωρίς bevacizumab: 0.6273 ± 0.345% έναντι 3.44 ± 1.076%, p=0.019). Μάλιστα, η χημειοθεραπεία χωρίς την προσθήκη bevacizumab συσχετίσθηκε με στατιστικά σημαντική αύξηση των επιπέδων των naive Treg στο περιφερικό αίμα των ασθενών (ποσοστά naive Treg προ και μετά από 3 κύκλους θεραπείας χωρίς bevacizumab: 1.456 ± 0.353% έναντι 3.44 ± 1.076% αντίστοιχα, p=0.045). Για τα effector Treg δεν παρατηρήθηκε κάποια στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των ασθενών που έλαβαν ή δεν έλαβαν bevacizumab (μέση μεταβολή στα ποσοστά των effector Treg, θεραπεία με bevacizumab έναντι θεραπείας χωρίς bevacizumab: 0.3818 ± 1.54% έναντι -1.59 ± 3.2%, p=0.49). Τέλος, μετά από 3 κύκλους θεραπείας οι ασθενείς που έλαβαν bevacizumab είχαν χαμηλότερα επίπεδα terminal effector Treg συγκριτικά με τους ασθενείς που δεν έλαβαν bevacizumab (ποσοστά terminal effector Treg μετά από 3 κύκλους θεραπείας, θεραπεία με bevacizumab έναντι θεραπείας χωρίς bevacizumab: 7.3 ± 2.958% έναντι 15.72 ± 3.128%, p=0.059). Συμπέρασμα: Συμπερασματικά, η παρούσα διδακτορική διατριβή περιγράφει σαφώς, φαινοτυπικά και λειτουργικά, διακριτούς υποπληθυσμούς MDSCs και Treg με προγνωστική αξία, στο περιφερικό αίμα ασθενών με ΜΜΚΠ. Η ποσοτικοποίηση της συχνότητάς τους στο περιφερικό αίμα αναδείχθηκε ως ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας επιβίωσης των ασθενών, ενισχύοντας τις προοπτικές της κλινικής χρησιμότητας του συγκεκριμένου βιοδείκτη. Η επιλεκτική στόχευση συγκεκριμένων υποπληθυσμών MDSCs και Treg μέσω της θεραπείας με bevacizumab παρέχει ενδείξεις αφενός για την ανοσοτροποιητική δράση της αντι-αγγειογενετικής θεραπείας και αφετέρου για την κλινική χρησιμότητά της ως ένα εργαλείο που θα περιορίσει το ανοσοκατασταλτικό δυναμικό σε ασθενείς με ΜΜΚΠ. Θα πρέπει να τονιστεί ωστόσο, ότι τα παραπάνω δεδομένα παραμένει να επιβεβαιωθούν προοπτικά σε τυχαιοποιημένες κλινικές μελέτες όπου θα ενταχθούν περισσότεροι ασθενείς, με μεγαλύτερη ομοιογένεια στον ιστολογικό τύπο και τη θεραπεία που λαμβάνουν και τα επίπεδα των κυκλοφορούντων MDSCs/Treg θα συσχετισθούν με την συχνότητά τους στη περιοχή του όγκου, όπου ασκούν την ανοσοκατασταλτική τους δράση. Είναι κοινός τόπος, ότι η αναβάθμιση της γνώσης μας για τα MDSCs και τα Treg κρίνεται θεμελιώδους σημασίας για το σχεδιασμό και την ανάπτυξη νέων στρατηγικών με στόχο την αποτελεσματική ανίχνευση και ποσοτικοποίηση του «ανοσοκατασταλτικού δυναμικού» στο μικροπεριβάλλον του όγκου και την επιλογή ασθενών με ΜΜΚΠ που πιθανώς θα επωφελούνταν από την εφαρμογή μιας ανοσοθεραπευτικής προσέγγισης.