Ανάπτυξη νέων βιοκαταλυτικών συστημάτων μέσω της ακινητοποίησης ενζύμων σε νανοδομικά υλικά

Abstract

The aim of this thesis is the development of novel nanobiocatalytic systems by means of immobilization of enzymes onto carbon-based nanostructured-supports, through the understanding of the correlation between structure and function of enzymes with these nanomaterials. Carbon-based nanomaterials such as carbon nanotubes and graphene oxide, functionalized with different length of alkyl chains and functional groups, were used to study the effect of their presence on the catalytic and structural characteristics of cytochrome c. The presence of these functionalized nanomaterials increases the catalytic efficiency of cytochrome c, as well the stability of the protein, as they protect it from thermal denaturation and hydrogen peroxide deactivation. Cytochrome c preserves its secondary structure in the presence of the functionalized nanomaterials, while the observed changes in the heme microenvironment suggest that the heme plane reorients in the active site pocket, possibly making the heme more accessible to the substrates and thus leading to higher peroxidase activity. Cytochrome c was further immobilized on functionalized derivatives of graphene oxide through physical adsorption and covalent binding. The immobilization efficiency and the catalytic behavior of the immobilized protein are affected by the surface chemistry, the alkyl chain length and the terminal functional group of the nanomaterials, as well as the immobilization procedure. The experimental results show that functionalized graphene oxide derivatives are excellent supports for protein immobilization. The thermostability of cytochrome c is improved upon immobilization, while the nanomaterials seem to offer a protective role against denaturing agents, such as methanol and hydrogen peroxide. The immobilization of cytochrome c on the functionalized nanomaterials results in changes in the secondary structure of the protein. More specific, a loss in the α-helical content is observed, while the content of β-sheets is increased, indicating that the protein undergoes a conformational transition to a more rigid structure, which could explain the increased stability of the immobilized protein. Finally, the development of multi-layer nanomaterial-enzyme nanoassemblies, through multi-point covalent immobilization was achieved for the synthesis of novel biocatalysts with improved properties which can be used in numerous industrial applications. The prepared nanobiocatalysts consist of alternate layers of laccase and amino-functionalized graphene oxide and present excellent thermal stability compared to the free enzyme. In addition, the multi-layer nanoassemblies present excellent oxidation activity against polycyclic aromatic hydrocarbons and dyes, while they are able to retain up to 94% of their initial activity after 5 uses. In conclusion, the results of this study demonstrate the significant benefits arising from the implementations of nanosturctured materials as supports for enzyme immobilization, and form the basis for the development of numerous applications in the field of nanobiotechnology.

Στόχος της παρούσας διατριβής είναι η ανάπτυξη νέων βιοκαταλυτικών συστημάτων μέσω της ακινητοποίησης ενζύμων σε νανοδομικά υλικά, μελετώντας και κατανοώντας τη σχέση δομής-λειτουργίας των ακινητοποιημένων ενζύμων με τα νανοϋλικά. Νανοσωλήνες άνθρακα και οξείδιο του γραφενίου, τροποποιημένα με διάφορου μήκους αλκυλικές αλυσίδες και διαφορετικές λειτουργικές ομάδες, χρησιμοποιήθηκαν για τη μελέτη της επίδρασης της παρουσίας τους στα καταλυτικά και δομικά χαρακτηριστικά του κυτοχρώματος c. Η παρουσία των νανοϋλικών αυτών αυξάνει τη δραστικότητα της πρωτεΐνης, καθώς και τη σταθερότητά της, προστατεύοντάς την από τη θερμική μετουσίωση και την απενεργοποίηση από υπεροξείδιο του υδρογόνου. Το κυτόχρωμα c διατηρεί τη δευτεροταγή δομή του παρουσία των νανοϋλικών, ενώ παρατηρούνται αλλαγές στο μικροπεριβάλλον της αίμης, που οδηγούν σε ένα πιο προσβάσιμο ενεργό κέντρο, με αποτέλεσμα την αυξημένη καταλυτική δραστικότητα της πρωτεΐνης. Στη συνέχεια, το κυτόχρωμα c ακινητοποιήθηκε σε τροποποιημένα παράγωγα οξειδίου του γραφενίου μέσω φυσικής προσρόφησης και ομοιοπολικής ακινητοποίησης. Η απόδοση της ακινητοποίησης και η δραστικότητα της πρωτεΐνης επηρεάζονται από τη σύσταση του νανοϋλικού, το μήκος της αλκυλικής αλυσίδας, τη λειτουργική ομάδα και τον τρόπο της ακινητοποίησης. Τα πειραματικά αποτελέσματα υποδεικνύουν ως κατάλληλους φορείς ακινητοποίησης τα τροποποιημένα νανοϋλικά. Η θερμική σταθερότητα της ακινητοποιημένης πρωτεΐνης βελτιώνεται σε σχέση με την ελεύθερη, ενώ ταυτόχρονα τα νανοϋλικά προστατεύουν το κυτόχρωμα c από παράγοντες όπως η μεθανόλη και το υπεροξείδιο του υδρογόνου. Η ακινητοποίηση του κυτοχρώματος c έχει ως αποτέλεσμα την αλλαγή της δευτεροταγούς δομής του. Διαπιστώθηκε μείωση της περιεκτικότητας σε α-έλικα με ταυτόχρονη αύξηση της περιεκτικότητας σε β-φύλλα, γεγονός που υποδηλώνει πως η πρωτεΐνη υιοθετεί μια πιο άκαμπτη διαμόρφωση που εξηγεί την αυξημένη σταθερότητα της ακινητοποιημένης πρωτεΐνης. Τέλος, επιτεύχθηκε η δημιουργία πολυστρωματικών νανοσυστοιχιών νανοϋλικού-ενζύμου, μέσω ομοιοπολικής ακινητοποίησης πολλαπλών σημείων, που οδηγεί στη δημιουργία καινοτόμων βιοκαταλυτών με βελτιωμένες ιδιότητες και πλήθος βιομηχανικών εφαρμογών. Οι νανοβιοκαταλύτες που παρασκευάσθηκαν αποτελούνται από εναλλασσόμενα στρώματα λακάσης-τροποποιημένου οξειδίου του γραφενίου, και παρουσιάζουν εξαιρετική σταθερότητα έναντι του ελεύθερου ενζύμου. Επιπλέον, παρουσιάζουν αυξημένη καταλυτική δραστικότητα κατά την οξείδωση πολυαρωματικών υδρογονανθράκων και χρωστικών, ενώ διατηρούν μέχρι και 94% της αρχικής τους δραστικότητας ύστερα από 5 κύκλους χρήσης. Εν κατακλείδι, τα νανοδομικά υλικά με βάση τον άνθρακα βελτιώνουν σημαντικά την καταλυτική δράση των οξειδοναγωγικών πρωτεϊνών, οδηγώντας στη δημιουργία βιοκαταλυτικών συστημάτων με ενδιαφέρουσες ιδιότητες. Τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής καταδεικνύουν τα σημαντικά πλεονεκτήματα που προκύπτουν από την εφαρμογή των νανοϋλικών ως φορείς ακινητοποίησης ενζύμων, και τα οποία αποτελούν τη βάση για την ανάπτυξη πλήθους εφαρμογών στο πεδίο της νανοβιοτεχνολογίας.