Χαρακτηριστικά βιοελέγχου των στελεχών Pseudomonas chlororaphis ToZa7, Serratia rubidaea S55, Serratia marcescens PiHa5II και Bacillus cereus S76, από ελληνικά αγρο-οικοσυστήματα

Abstract

Consumer pressure for quality products free of agrochemical residues has led to the need for adopting methods by which products are produced at the lowest possible cost and with less environmental impact. Such a strategy also includes the use of beneficial microorganisms that achieve biological control of diseases and are called biological control agents (BCAs). Biological control agents in many cases promote plant growth and are therefore called Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR).The present study is focused on investigating the mode of action of four rhizobacterial strains with proven antifungal and disease suppression activity. The strains Pseudomonas chlororaphis ToZa7, Serratia rubidaea S55, Serratia marcescens PiHa5II and Bacillus cereus S76 were selected for their ability to suppress Fusarium oxysporum f. sp. radicis - lycopersici (Forl), in in vitro and in planta experiments. While investigating the mode of action of S. rubidaea S55 and P. chlororaphis ToZa7, two important antibiotics were isolated, characterized and evaluated in vitro. P. chlororaphis ToZa7 produced phenazine (phenazine-1-carboxamide, PCN) and S. rubidaea S55 produced prodigiosin (2-methyl-3-pentyl-6-methoxy prodigiosin). The inhibition of the pathogenic fungus Forl, as well as the fungal biocontrol agent Clonostachys rosea IK726, after the effect of the partially purified antibiotics, was strong. The inhibitory action of the bacterial culture crude extracts was further studied, calculating EC50 (Half maximal Effective Concentration) values. The above experiments underline the importance of antibiotics for bacterial biocontrol agents when they interact with phytopathogenic fungi but also with beneficial microorganisms.The ability of the biocontrol agents to produce antimicrobial compounds, other than antibiotics, as well as plant growth regulators, was also studied. All strains were proven capable of producing siderophores and proteases, while P. chlororaphis ToZa7 additionally produces hydrogen cyanide. The production of these compounds can explain their ability to significantly restrict the growth of Forl and the intensity of the tomato foot and root rot. Regarding the production and secretion of phytohormones, all strains were able to produce indoleacetic acid, and S. marcescens PiHa5II which was the most important producer, caused the strongest growth promotion observed in various plants. In this prospect, macro-elements N, C, S, K, Ca, Mg and P contents were determined in radish plants, treated with the aforementioned rhizobacteria. Regarding the above-groung part of radish, S. marcescens PiHa5II significantly increased the absorption of potassium in leaves, while treatment with P. chlororaphis ToZa7 increased the absorption of magnesium. Regarding the underground part, differences in calcium and phosphorus concentration were observed, after treatment with P. chlororaphis Toza7 and B. cereus S76, respectively. Regarding nitrogen, carbon and sulfur (N, C, S), in the above-ground part, the results showed that P. chlororaphis ToZa7 increased the accumulation of nitrogen, while the accumulation of carbon was positively affected by the presence of B. cereus S76. In the underground part, P. chlororaphis ToZa7 significantly increased the accumulation of nitrogen and carbon, while sulfur concentration lowered after S. marcescens PiHa5II treatment, compared to control plants that were not treated with bacteria.The possibility of combined application of strains S. rubidaea S55 and P. chlororaphis ToZa7 with C. rosea IK726 was also studied. Investigation of the possible combination was initially made by studying the expression of 14 ABC transporter genes in C. rosea IK726, using the quantitative reverse transcription PCR. The gene expression analysis showed significant induction in expression of abcB1, abcB26, abcG8 and abcG25 genes, in mycelium grown in 24-hour culture supernatant of S. rubidaea S55. However, no significant induction was observed in the 24-hour culture supernatant of P. chlororaphis ToZa7. In addition, when the fungus was grown in a 72-hour culture supernatant of S. rubidaea S55, 5 genes (abcC14, abcC12, abcB20, abcB1, and abcB26) were upregulated, whereas the growth in a 72-hour supernatant of P. chlororaphis ToZa7 caused induction of only 3 genes (abcC14, abcB1, and abcB26). The importance of the genes encoding the ABC transporters is that they putatively allow the fungus’ cells to detoxify from secondary toxic metabolites. However, positive effects of the combination of the above biocontrol agents was verified in in planta experiments on tomato, in pots, under controlled conditions, where suppression of tomato foot and root rot by Forl, was observed. In order to explain the ability of S. rubidaea S55, P. chlororaphis Toza7 and C. rosea IK726 to suppress the disease, the induction of genes related to mechanisms of resistance in tomato plants, was investigated after induction inoculation with S. rubidaea S55 and P. chlororaphis ToZa7 in combination with C. rosea IK726 and separately, followed by challenge inoculation with Forl. Gene expression was tested in tomato roots, under controlled conditions, and the genes studied were PR-1a, GLUA and CHI3 encoding PR-1, PR-2, PR-3 proteins, respectively. PR-1a gene expression level was higher in tomato after treatment with C. rosea IK726, and challenge inoculation with Forl, 48 hours later. The same was observed after treatment of a combination of C. rosea IK726 with P. chlororaphis ToZa7. This gene was also expressed when challenge inoculation with Forl was applied 72 hours after the induction inoculation with S. rubidaea S55. Expression of CHI3 gene was higher when challenge inoculation with Forl was applied 48 hours after treatment with C. rosea IK726. Regarding the GLUA gene, its level of expression slightly increased after treatment with Forl, applied 72 hours after induction inoculation with S. rubidaea S55 and C. rosea IK726 and C. rosea IK726 + S. rubidaea S55. However, PR-1a and GLUA gene expression levels increased significantly in tomato after exposure to the P. chlororaphis ToZa7 strain for 120 hours, without challenge inoculation with the pathogenFinally, in order to further study the interactions of C. rosea IK726 and Forl in the rhizosphere, the two fungi were transformed with the green fluorescent protein (GFP) and red fluorescent protein (DsRed) genes, respectively. Observations under a confocal laser scanning microscope (CLSM) revealed the ability of C. rosea IK726 to colonize the root system of tomato rapidly and efficiently. In vitro observations have further supported the hypothesis that the primary mode of action of C. rosea IK726 is hyperparasitism of the phytopathogenic fungus. Finally, colonization of the tomato roots by P. chlororaphis Toza7 was studied. CLSM revealed that this strain successfully colonizes the tomato roots and further on, its endophytic ability was confirmed by isolation from the interior of the epidermal cells.

Η πίεση των καταναλωτών για παραγωγή ποιοτικών προϊόντων, καθαρών από υπολείμματα αγροχημικών, οδήγησαν στην ανάγκη υιοθέτησης μεθόδων που στοχεύουν στην παραγωγή προϊόντων µε το ελάχιστο δυνατό κόστος και τη μικρότερη επιβάρυνση του περιβάλλοντος. Στο πλαίσιο μιας τέτοιας στρατηγικής εντάσσεται και η χρήση ωφέλιμων μικροοργανισμών που πετυχαίνουν βιολογική καταπολέμηση των ασθενειών και ονομάζονται παράγοντες βιολογικού ελέγχου ή παράγοντες βιολογικής καταπολέμησης (biological control agents, BCAs). Οι βακτηριακοί παράγοντες βιολογικού ελέγχου σε πολλές περιπτώσεις προάγουν την αύξηση των φυτών και για αυτό καλούνται Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR). Η παρούσα εργασία στοχεύει στη διερεύνηση του τρόπου δράσης τεσσάρων στελεχών ριζοβακτηρίων με αποδεδειγμένη ικανότητα βιοελέγχου. Συγκεκριμένα, τα στελέχη Pseudomonas chlororaphis ToZa7, Serratia rubidaea S55, Serratia marcescens PiHa5II και Bacillus cereus S76 επιλέχθηκαν για την ικανότητά τους να καταστέλλουν, σε πειράματα in vitro και in planta, τον μύκητα Fusarium oxysporum f. sp. radicis – lycopersici (Forl). Στο πλαίσιο του παραπάνω στόχου, απομονώθηκαν, χαρακτηρίστηκαν και αξιολογήθηκαν in vitro, δύο σημαντικές αντιβιοτικές ενώσεις, το καρβοξαμίδιο της φαιναζίνης (phenazine-1-carboxamide, PCN) και η προδιγιοσίνη (2-methyl-3-pentyl-6-methoxy prodigiosin), από τα στελέχη P. chlororaphis ToZa7 και S. rubidaea S55, αντίστοιχα. Η αναστολή της ανάπτυξης του παθογόνου μύκητα Forl αλλά και του μύκητα Clonostachys rosea IK726 μετά την εφαρμογή και των δύο μερικά καθαρισμένων αντιβιοτικών ουσιών, ήταν έντονη. Στη συνέχεια μελετήθηκε η επίδραση ακατέργαστων εκχυλισμάτων καλλιεργειών των βακτηρίων επί των δύο προαναφερθέντων μυκήτων σε in vitro πειράματα, υπολογίζοντας τις τιμές EC50 (Half maximal Effective Concentration). Τα παραπάνω πειράματα συνεισφέρουν στην κατανόηση της σημασίας των αντιβιοτικών ουσιών για τη δράση των συγκεκριμένων βακτηριακών στελεχών κατά των φυτοπαθογόνων μικροοργανισμών αλλά και πώς αυτά μπορεί στο πεδίο δράσης τους να αναστέλλουν και ωφέλιμους μικροοργανισμούς. Στη συνέχεια μελετήθηκε η ικανότητα των βιοπαραγόντων να παράγουν άλλες αντιμικροβιακές ουσίες, πλην των αντιβιοτικών, αλλά και ρυθμιστές ανάπτυξης. Επιβεβαιώθηκε η ικανότητα παραγωγής σιδηροφόρων και πρωτεασών από όλα τα στελέχη ενώ το P. chlororaphis ToZa7 αποδείχτηκε ικανό να παράγει επιπλέον και υδροκυάνιο. Η παραγωγή αυτών των ενώσεων μπορεί να εξηγήσει την ικανότητά τους να περιορίζουν σημαντικά την ανάπτυξη του μύκητα Forl και την ένταση της σήψης λαιμού και ριζών της τομάτας που αυτός προκαλεί. Όσον αφορά στην παραγωγή και έκκριση φυτορμονών, όλα τα στελέχη αποδείχτηκαν ικανά να παράγουν ινδολοξικό οξύ με κορυφαίο στέλεχος το S. marcescens PiHa5II το οποίο προκάλεσε και την εντονότερη προαγωγή της αύξησης που παρατηρήθηκε σε διάφορα φυτά. Σε αυτό το πλαίσιο προσδιορίστηκε η περιεκτικότητα των μακροστοιχείων N, C, S, Κ, Ca, Mg και Ρ σε φυτά ρεπανιού που είχαν δεχτεί επεμβάσεις με τα ριζοβακτήρια. Όσον αφορα το υπέργειο τμήμα, το βακτήριο S. marcescens PiHa5ΙΙ αύξησε σημαντικά την απορρόφηση του καλίου στα φύλλα, ενώ η επέμβαση με το P. chlororaphis ToZa7 αύξησε σημαντικά την απορρόφησή του μαγνησίου. Όσον αφορά το υπόγειο τμήμα, παρατηρήθηκαν διαφορές μόνο στις μετρήσεις απορρόφησης του ασβεστίου και του φωσφόρου, τα οποία αυξήθηκαν μετά από τον εμβολιασμό με τα στελέχη P. chlororaphis ToZa7 και B. cereus S76 αντίστοιχα. Όσον αφορά στα βασικά θρεπτικά στοιχεία, άζωτο, άνθρακα και θείο (N, C, S), στο υπέργειο τμήμα, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το P. chlororaphis ToZa7 αυξάνει στατιστικά σημαντικά την απορρόφηση και συσσώρευση του αζώτου, ενώ η απορρόφηση του άνθρακα επηρεάζεται από την παρουσία του B. cereus S76, το οποίο και αυξάνει σημαντικά την συγκέντρωση του στοιχείου στα φύλλα, σε σύγκριση με τον μάρτυρα. Στο υπόγειο τμήμα, το στέλεχος P. chlororaphis ToZa7 αυξάνει σημαντικά τη συσσώρευση του αζώτου και του άνθρακα, ενώ η επέμβαση με το S. marcescens PiHa5II μειώνει τη συγκέντρωση του θείου σε σύγκριση με τα φυτά του μάρτυρα που δεν έχουν υποστεί βακτηριακή μεταχείριση.Στη συνέχεια μελετήθηκε η προοπτική συνδυασμού των στελεχών S. rubidaea S55 και P. chlororaphis ToZa7 με τον C. rosea IK726. Η διερεύνηση έγινε αρχικά μέσω της μελέτης της έκφρασης 14 γονιδίων μεταφορέων ABC στον C. rosea IK726, με τη χρήση της ποσοτικής PCR αντίστροφης μεταγραφής. Η ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης έδειξε σημαντική επαγωγή στην έκφραση των γονιδίων abcB1, abcB26, abcG8 και abcG25 στο μυκήλιο που αναπτύχθηκε σε υπερκείμενο καλλιέργειας 24 ωρών, του S. rubidaea S55. Ωστόσο, καμία σημαντική επαγωγή δεν παρατηρήθηκε στο αντίστοιχο υπερκείμενο του P. chlororaphis ToZa7. Επιπλέον, όταν ο μύκητας αναπτύχθηκε σε υπερκείμενο καλλιέργειας 24 και 72 ωρών του S. rubidaea S55, 5 γονίδια (abcC14, abcC12, abcB20, abcB1, και abcB26) εκφράστηκαν σημαντικά περισσότερο, ενώ η αντίστοιχη ανάπτυξη σε υπερκείμενο 72 ωρών του P. chlororaphis ToZa7 προκάλεσε την επαγωγή 3 μόνο γονιδίων (abcC14, abcB1, και abcB26). Η σημασία των γονιδίων που κωδικοποιούν τους μεταφορείς ABC έγκειται στο ότι προσδίδουν στον μύκητα την ικανότητα αποτοξίνωσης του κυττάρου από δευτερογενείς μεταβολίτες. Η θετική επίδραση του συνδυασμού των βιοπαραγόντων διαπιστώθηκε σε in planta πειράματα σε τομάτα, σε φυτοδοχεία, υπό ελεγχόμενες συνθήκες, όπου και παρουσίασαν ικανοποιητική φυτοπροστατευτική δράση έναντι του Forl. Προκειμένου να συνδεθεί η αρνητική επίδραση των βιοπαραγόντων S. rubidaea S55, P. chlororaphis ToZa7 και C. rosea IK726 στη σήψη ριζών και λαιμού, διερευνήθηκε η επαγωγή γονιδίων που σχετίζονται με μηχανισμούς άμυνας σε φυτά τομάτας, μετά από προσβολή από τον μύκητα Forl και εμβολιασμό των στελεχών S. rubidaea S55 και P. chlororaphis ToZa7 σε συνδυασμό με τον C. rosea IK726 και μεμονωμένα. Η γονιδιακή έκφραση ελέγχθηκε σε ρίζες φυτών τομάτας που αναπτύχθηκαν σε φυτοδοχεία, υπό ελεγχόμενες συνθήκες και τα γονίδια που μελετήθηκαν ήταν τα PR-1a, GLUA και CHI3 τα οποία κωδικοποιούν αντιμικροβιακές πρωτεΐνες τύπου PR-1, PR-2, PR-3, αντίστοιχα. Τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου PR-1a ήταν υψηλότερα στην τομάτα μετά από μόλυνση πρόκλησης με το παθογόνο 48 ώρες από τον εμβολιασμό επαγωγής με τον C. rosea IK726. Το ίδιο παρατηρήθηκε και ύστερα από εμβολιασμό επαγωγής με συνδυασμό του C. rosea IK726 με το P. chlororaphis ToZa7. Το γονίδιο αυτό έδειξε να εκφράζεται εντονότερα και όταν επέδρασε στο φυτό το S. rubidaea S55 και 72 ώρες αργότερα ακολούθησε μόλυνση πρόκλησης με το παθογόνο. Το γονίδιο CHI3 εκφράστηκε περισσότερο όταν η μόλυση πρόκλησης με το παθογόνο έγινα 48 ώρες μετά τον εμβολιασμό επαγωγής με C. rosea. Όσον αφορά στο γονίδιο GLUA, τα επίπεδα έκφρασής του στην τομάτα αυξήθηκαν ελάχιστα μετά από μόλυνση πρόκλησης που έγινε 72 ώρες μετά τον εμβολιασμό επαγωγής με S. rubidaea S55 και με C. rosea ΙΚ726 καιμε C. rosea ΙΚ726 S. rubidaea S55. Ωστόσο, τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων PR-1a και GLUA αυξήθηκαν σημαντικά στην τομάτα, μετά από έκθεση στο στέλεχος P. chlororaphis ToZa7, για 120 ώρες, χωρίς να ακολουθήσει μόλυνση πρόκλησης με το παθογόνο. Τέλος, στο πλαίσιο της μελέτης των αλληλεπιδράσεων του C. rosea IK726 και του Forl στη ριζόσφαιρα, οι δύο μύκητες μετασχηματίστηκαν με τα γονίδια της πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης (GFP) και της κόκκινης φθορίζουσας πρωτεΐνης (DsRed), αντίστοιχα. Οι παρατηρήσεις σε συνεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης με ακτίνες laser φανέρωσαν την ικανότητα αποικισμού του ριζικού συστήματος της τομάτας από τον ωφέλιμο μύκητα C. rosea IK726. Παράλληλες παρατηρήσεις in vitro ενίσχυσαν την υπόθεση ότι ο βασικός τρόπος δράσης του C. rosea IK726 είναι ο υπερπαρασιτισμός των υφών του φυτοπαθογόνου μύκητα. Τέλος, μελετήθηκε ο αποικισμός του ριζικού συστήματος της τομάτας από το στέλεχος P. chlororaphis Τοζα7. Το στέλεχος ΤοΖα7 μετασχηματίστηκε με το γονίδιο της πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης μέσω βακτηριακής σύζευξης. Έξι ημέρες μετά τον εμβολιασμό παρατηρήθηκε ότι το ριζοβακτήριο αποίκισε τα ριζικά τριχίδια και τα επιφανειακά κύτταρα της τομάτας, ενώ επιβεβαιώθηκε η ενδοφυτική του ικανότητα με απομόνωση από το εσωτερικό των επιδερμικών κυττάρων.