Μηχανισμοί ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης από τον ιό Epstein-Barr

Abstract

The Epstein-Barr virus (EBV) is a widely spread human herpes virus that has the ability to infect epithelial cells as well as B-lymphocytes following either a lytic cycle or a latent one.The protein LMP1 is the major oncogenic protein of EBV as it persists the ability to transform fibroblasts. It is fully necessary for the immortalization procedure of B-lymphocytes through EBV and is detected in the majority of the neoplasia linked to EBV. LMP1 contains in its carboxy terminal end 2 regions (CTAR1 and CTAR2) that bind various cytoplasmic factors that are implicated in the different pathways triggered by LMP1. Among those factors is the TRAF protein family, from which 5 members (TRAF1, -2, -3, -5 and -6) are implicated in the signaling through LMP1 that induce the NFκB pathway as well as the pathways of JNK and p38 (MAP kinases).Besides protein phosphorylation the procedure of dephosphorylation is equally important to bring back the proteins to their initial state. Protein complexes PP2 and PP4 are from the best known phosphatases. The regulatory subunit of the PP4 complex interacts with the RING domain of TRAF2.During this PhD thesis it was discovered that TRAF5 seems to be of great importance for the viability of two different cell lines infected with EBV using the RNA interference method. In addition stable cell lines, originating from the cell line HEK293T, were produced expressing the viral protein LMP1 and simultaneously having either TRAF1, TRAF2 or TRAF3 downregulated. Using these stable line it was found that TRAF3 probably is a negative regulator to the expression of two target genes of NFκB, ΙκΒα and MCP1.Finally the interaction between PP4R1 and the RING domain of both TRAF2 and TRAF6 was confirmed. In addition the role of PP4R1 in the inhibition of the NFκB pathway was also confirmed. Also it was found that PP4R1 is responsible for the dephosphorylation of TRAF2 at the amino acid serine 11 but not serine 55, whose phosphorylation seems to improve the binding between TRAF2 and PP4R1.

Ο ιός Epstein-Barr (EBV) είναι ένας ευρύτατα διαδεδομένος ανθρώπινος ερπητοϊός που έχει την ικανότητα να μολύνει επιθηλιακά κύτταρα και Β λεμφοκύτταρα ακολουθώντας είτε μια λυτική είτε μία λανθάνουσα πορεία.Η πρωτεΐνη LMP1 είναι η κύρια ογκογονική πρωτεΐνη του EBV καθώς έχει αυτόνομη ικανότητα μετασχηματισμού ινοβλαστών, είναι απόλυτα απαραίτητη για την διαδικασία της αθανατοποίησης των Β λεμφοκυττάρων από τον EBV και εκφράζεται στις περισσότερες νεοπλασίες που σχετίζονται με τον EBV. Η LMP1 στο καρβοξυτελικό της άκρο περιέχει 2 περιοχές (CTAR1 και CTAR2) που αποτελούν θέσεις πρόσδεσης διάφορων κυτταροπλασματικών παραγόντων που λαμβάνουν μέρος στα διάφορα σηματοδοτικά μονοπάτια που ενεργοποιεί η πρωτεΐνη LMP1. Ανάμεσα στους κυτταροπλασματικούς παράγοντες που έχουν εμπλακεί στη σηματοδότηση από την LMP1 είναι η οικογένεια των πρωτεϊνών TRAF εκ της οποίας τα 5 μέλη (TRAF1, -2, -3, -5 και -6) έχουν εμπλακεί στη σηματοδότηση της LMP1 που οδηγεί στην ενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα NF-κB και των κινασών JNK και p38 που ενεργοποιούνται από μιτογόνα (MAP κινάσες).Εκτός από την φωσφορυλίωση των πρωτεϊνών εξίσου σημαντική διαδικασία είναι η αποφωσφορυλίωση και η επαναφορά τους στην αρχική τους κατάσταση. Από της πιο γνωστές φωσφατάσες είναι τα σύμπλοκα πρωτεϊνών PP2 και PP4. Η ρυθμιστική υπομονάδα της φωσφατάσης PP4 αλληλεπιδρά με την επικράτεια RING της πρωτεΐνης TRAF2.Στα πλαίσια της διδακτορικής διατριβής βρέθηκε πως η πρωτεΐνη TRAF5 δείχνει να είναι σημαντική για την επιβίωση δύο κυτταρικών σειρών Β-κυττάρων μολυσμένων με τον ιό EBV με τη χρήση της μεθόδου της παρεμβολής του RNA. Επίσης δημιουργήθηκαν σταθερές κυτταρικές σειρές από την σειρά HEK293T που εκφράζουν την ιική πρωτεΐνη LMP1 και ταυτόχρονα έχουν μια εκ των πρωτεϊνών TRAF1, TRAF2 ή TRAF3 να εκφράζεται σε κατεσταλμένα επίπεδα. Με τη βοήθεια των κυττάρων αυτών βρέθηκε επίσης πως η πρωτεΐνη TRAF3 έχει αρνητικό ρόλο στην ενεργοποίηση των γονιδίων στόχων του NFκB IκBα και MCP1.Τέλος επιβεβαιώθηκε η αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης PP4R1 με την περιοχή RING των πρωτεϊνών TRAF2 και TRAF6. Βρέθηκε επίσης ο ρόλος που έχει στην καταστολή του μονοπατιού του μεταγραφικού παράγοντα NFκB. Όπως και βρέθηκε πως η PP4R1 ευθύνεται για την αποφωσφορυλίωση της TRAF2 στην σερίνη 11 αλλά όχι στην σερίνη 55, η οποία όμως φωσφορυλίωση ενισχύει την αλληλεπίδραση μεταξύ των πρωτεϊνών TRAF2 και PP4R1.