Ανάλυση της επίδρασης του άξονα σηματοδότησης insulin - PI3k – mTOR- p70s6k στη βιολογία των νευρικών κυττάρων

Abstract

The dysregulation of the "Insulin - PI3k - mTOR - p70s6k» axis has been associated with the development of serious diseases, such as cancer. Consequently, the inhibition of the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway with specific agents represents a clinically relevant target and has been employed to combat various types of cancers, including neuroblastoma.The results of this study revealed that targeting molecules which are acting upstream on this pathway, such as the PI3K kinase, leads to a reversible inhibition of neuroblastoma cell proliferation, by forcing the cells to enter a G0-like state or quiescence, as it is shown by the significant reduction of Ki67 and the increase in p27 protein levels, a phenomenon which is reversed after removal of the inhibitor. In contrast, the application of drugs acting downstream on this signaling axis, such as the mTOR inhibitor rapamycin causes permanent changes in the biology of neuroblastoma cells, including inhibition of the differentiation potential and abnormal proliferation, the latter reflected by an unusually rapid passage through the early prophase stages of mitosis after the removal of the drug. Importantly, these phenomena are accompanied by an irreversible inhibition of the p70s6k kinase activity. We further observed that activation of stress response pathways such as the p38MAPK kinase cascade is essential for both, the activation of p70s6k and the recovery of cells, after drug withdrawal, since inhibition of p38MAPK impairs the expression of the proliferation markers Ki67 and PH3, and the formation of midbodies. Interestingly, the inhibition of p38MAPK activity during recovery from rapamycin treatment induces a survival state in which the cells do not proliferate (Ki67-), and they also form primary cilia, microtubule-based organelles known to be involved in sensing the surrounding milieu and processing of developmental signals. The presence of these structures in neuronal progenitors has also been shown to be essential for the spatial organization of the cells in the neural tissues. Interestingly, the induction of ciliogenesis was observed only during recovery of the cells from the inhibition of mTOR, which may be related to the deregulation of the cell cycle checkpoint control mechanisms by rapamycin.In conclusion, our data reveal an interplay between the mTOR - p38 - p70s6k molecules which appears to have an active role in the recovery of neuroblastoma cell from stress conditions that are caused by the inhibition of the PI3k/Akt – mTOR axis. Thus, therapies that are based on application of drugs (like the rapalogs) which inhibit mTOR, either as monotherapy, or in combination with inhibitors of molecules that induce survival, such as the p38MAPK kinase, may not be effective because the cells can acquire new properties. In contrast, approaches which are based on targeting molecules that are located upstream of the PI3k - mTOR pathway (such analogs of LY294002) in combination with inhibition of p38MAPK or of the chaperon protein Hsp90, might provide a new strategy for treating cancers such as neuroblastoma. Finally, from this work it is disclosed that neuroblastoma cells have mechanisms of inducing ciliogenesis, a process that merits further investigation since it can be associated with the development of chemoresistance, and hence could be an attractive target for drug development against this disease.

Διαταραχές στην ενεργοποίηση του άξονα «Iνσουλίνη - PI3k – mTOR - p70s6k» έχουν συνδεθεί με την ανάπτυξη ασθενειών, ανάμεσά τους και ο καρκίνος. Η αναστολή των μονοπατιών PI3k/Akt και mTOR με εξειδικευμένους αναστολείς όπως είναι χημικά μόρια με δράση ανάλογη του LY294002 και της ραπαμυκίνης, αποτελεί μια από τις στρατηγικές που έχουν χρησιμοποιηθεί ευρύτατα για την καταπολέμηση διαφόρων τύπων καρκίνων, όπως είναι το νευροβλάστωμα. Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης έδειξαν ότι η στόχευση μορίων, που βρίσκονται ανοδικά στο μονοπάτι αυτό, όπως είναι η PI3k αναστέλλει με αντιστρεπτό τρόπο τον πολλαπλασιασμό των νευροβλαστωματικών κυττάρων καθώς τα οδηγεί σε μια κατάσταση ομοιάζουσα της G0, όπως φαίνεται από την ελαχιστοποίηση της έκφρασης της πρωτεΐνης ki67 και την αύξηση της p27, ένα φαινόμενο το οποίο αντιστρέφεται μετά την απομάκρυνση του αναστολέα LY294002. Αντίθετα, η δράση της ραπαμυκίνης, η οποία στοχεύει σε μόρια που βρίσκονται χαμηλά στο μονοπάτι όπως είναι το mTOR, προκαλεί μόνιμες μεταβολές στη βιολογία των κυττάρων, όπως είναι η παρεμπόδιση της διαφοροποίησης και η μη ομαλή πρόοδος του πολλαπλασιασμού (γρήγορη διέλευση από τις φάσεις της μίτωσης μετά την απομάκρυνσή της), διαδικασίες οι οποίες συνοδεύονται από αναστολή της ενεργότητας της κινάσης p70s6k. H δράση μονοπατιών που ενεργοποιούνται σε συνθήκες στρες, όπως είναι η σηματοδότηση από την p38MAPK είναι απαραίτητη για την ενεργοποίηση της p70s6k και την ανάκαμψη των κυττάρων, αφού η αναστολή της μετά την απομάκρυνση του LY294002 και της ραπαμυκίνης οδηγεί σε μείωση της έκφρασης των μορίων – δεικτών του πολλαπλασιασμού στα κύτταρα (Ki67, pH3 και ακετυλιωμένη τουμπουλίνη). Παρατηρήσαμε επίσης ότι η αναστολή της p38MAPK κατά την ανάκαμψη από ραπαμυκίνη, οδηγεί τα κύτταρα σε μια εναλλακτική κατάσταση επιβίωσης, κατά την οποία τα κύτταρα δεν πολλαπλασιάζονται (Ki67-) και εμφανίζουν χαρακτηριστικές τριχοειδείς προεκβολές, που είναι γνωστές ως πρωτογενή μικροτριχίδια (primary cilia). Η παρουσία αυτών των δομών στα πρόδρομα νευρικά κύτταρα είναι θεμελιώδης για την χωρική οργάνωση των κυττάρων στους νευρικούς ιστούς. Ο σχηματισμός των μικροτριχιδίων παρατηρήθηκε μόνο κατά την ανάκαμψη από την αναστολή του mTOR και όχι της κινάσης PI3K, γεγονός που ίσως συνδέεται με την απορρύθμιση των σημείων ελέγχου του κυτταρικού κύκλου από τη ραπαμυκίνη. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης αναδεικνύουν για πρώτη φορά μια αλληλεπίδραση μεταξύ των πρωτεϊνών mTOR – p38 – p70s6k, η οποία φαίνεται ότι έχει ενεργό ρόλο στην ανάκαμψη των νευροβλαστωματικών κυττάρων από συνθήκες στρες που προκαλούνται από την παρεμπόδιση του άξονα PI3k/Akt – mTOR. Κατά συνέπεια, θεραπείες που στηρίζονται στη χρήση φαρμάκων (όπως ανάλογα της ραπαμυκίνης) που αναστέλλουν το mTOR είτε ως μονοθεραπεία είτε σε συνδυασμό με αναστολείς μορίων που επάγουν την επιβίωση, όπως η p38MAPK, ενδέχεται να μην είναι αποτελεσματικές επειδή τα κύτταρα μπορεί να αποκτούν νέες ιδιότητες. Αντίθετα, προσεγγίσεις που στοχεύουν σε μόρια που βρίσκονται ανοδικά στο μονοπάτι PI3k – mTOR (όπως μόρια ανάλογα του LY294002) σε συνδυασμό με την αναστολή της p38MAPK ή της Hsp90 θα μπορούσαν να αποτελούν έναν νέο τρόπο αντιμετώπισης καρκίνων όπως το νευροβλάστωμα. Αποκαλύπτεται τέλος, ότι τα νευροβλαστωματικά κύτταρα έχουν μηχανισμούς δημιουργίας πρωτογενών μικροτριχιδίων, ένα χαρακτηριστικό που αξίζει περαιτέρω διερεύνηση, αφού μπορεί να συνδέεται με την ανάπτυξη χημειοανθεκτικότητας, και θα μπορούσε να αποτελέσει έναν ελκυστικό φαρμακευτικό στόχο για την αντιμετώπισή του νευροβλαστώματος.