Διερεύνηση κριτηρίων συνδυασμένης αντί EGFR/VEGF στοχευμένης θεραπείας στο αδενοκαρκίνωμα του παχέος εντέρου σε ιστικές μικροσυστοιχίες

Abstract

Overexpression of epidermal growth factor receptor (EGFR) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in colon adenocarcinoma (CA) is a frequent event, whereas specific deregulation mechanisms in the corresponding signaling pathways remain under investigation. Our aim was to co-evaluate their expression correlated to the hypoxia inducible factor 1alpha (HIF-1a), which activates the transcription of VEGF gene.60 paraffin-embedded primary CAs were cored at 1.5 mm diameter and transferred to the microarray block. Immunohistochemistry (IHC) was performed using anti-EGFR, -VEGF, and -HIF 1a monoclonal antibodies. Concerning EGFR, quantitative evaluation was based on a semi-automated analysis system. Chromogenic in situ hybridization (CISH) was performed using EGFR gene and chromosome 7 centromeric probes.Protein overexpression was observed in 13/60 (21.6%), 45/60 (75%) and 7/60 (11.6%) cases regarding EGFR, VEGF, and HIF 1a, respectively. CISH analysis detected 4/60 (6.6%) EGFR gene amplified cases, whereas chromosome 7 aneuploidy was identified in 11/60 (18.3%) cases. Significant associations raised correlating stage to chromosome 7 (p=0.024), HIF 1a expression to tumor anatomical location (p=0.019) and also VEGF to HIF 1a expression (p=0.001), whereas EGFR expression was not associated to EGFR gene copies.According to our results, chromosome 7 instability is correlated to advanced disease, whereas a significant subset of CAs demonstrates an alternative, non- HIF 1a depended mechanism of VEGF overexpression. Furthermore, EGFR protein overexpression does not predict a specific gene deregulation mechanism.

Σκοπός της βασικής αυτής έρευνας αποτέλεσε η ανάλυση της έκφρασης των πρωτεϊνών EGFR,VEGF και HIF-1a, η ανάλυση των αριθμητικών ανωμαλιών του γονιδίου και η συσχέτισή τους με κλινικοργαστηριακές παραμέτρους της νόσου (αδενοκαρκίνωμα του παχέος εντέρου).Το υλικό αναδύθηκε από την αρχειακή ιστική βάση του Παθολογοανατομικού Τμήματος του 417 ΝΙΜΤΣ και αφορούσε σε –εμπεδωμένα σε κύβους παραφίνης- εξήντα (η=60) σποραδικά πρωτοπαθή αδενοκαρκινώματα παχέος εντέρου, προϊόντα τοπικής ή εκτεταμένης κολεκτομής, βαθμονομημένα- όσον αφορά την διαφοροποίηση- σύμφωνα με τα ιστολογικά κριτήρια της WHO και σταδιοποιημένα σύμφωνα με το σύστημα Astler-Coller. Ως ομάδα ελέγχου χρησιμοποιήθηκαν 10 φυσιολογικοί εντερικοί βλεννογόνοι. Τα δείγματα εμπεδώθηκαν σε κύβους παραφίνης, ελήφθησαν τομές με τη τεχνική ιστικών μικροσυστοιχιών, στις οποίες έγινε ανοσοϊστοχημεία και υβριδισμός.Η ΙΗC ήταν επιτυχής για όλες τις περιπτώσεις. Η υπερέκφραση του EGFR παρατηρήθηκε στις 13/60 (21.6%) των περιπτώσεων, ενώ στις υπόλοιπες 47 υπήρξε χαμηλή ή καθόλου έκφραση της πρωτεΐνης. Σύμφωνα με τα συμβατικά κριτήρια εκτίμησης 7 περιπτώσεις εκτιμήθηκαν ως 3+ και 6 ως 2+. CIA για την EGFR protein έδειξε ότι 5 περιπτώσεις είχαν υψηλές τιμές και 8 μέτριες. Η έκφραση της EGFR είχε σημαντικά στατιστική συσχέτιση με το φύλο (p=0.009). Η υπερέκφραση της VEGF εκτιμήθηκε σε 45/60 (75%) των περιπτώσεων και δεν διαπιστώθηκε συσχέτιση με τις κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους. Ο HIF1a υπερεκφράσθηκε στ 7/60 (11.6%) των περιπτώσεων και συσχετίστηκε σημαντικά με την προέλευση του όγκου (p=0.019), ενώ η έκφραση του VEGF παρουσίασε οριακή συσχέτιση (p=0.098). Επίσης στατιστικά σημαντική συσχέτιση παρατηρήθηκε μεταξύ VEGF και HIF1a (p=0.001). Ενδιαφέρον είναι το γεγονός ότι η υπερέκφραση του HIF1a συνοδεύτηκε με υπερέκφραση του VEGF, όχι όμως και το αντίστροφο. Επίσης μόνο μια περίπτωση υπερέκφρασης του EGFR συνοδεύτηκε από HIF1a υπερέκφραση.Η CISH ήταν επιτυχής για όλες τις περιπτώσεις που εξετάσθηκαν. Το EGFR gene ήταν φυσιολογικό (2 αντίγραφα γονιδίου ανά πυρήνα), σε 46 περιπτώσεις, ενώ στις υπόλοιπες 14 περιπτώσεις παρατηρήθηκαν αριθμητικές αλλαγές. Στις 13 από αυτές ανιχνεύθηκαν 3-10 αντίγραφα γονιδίων και στην 1 τελευταία μικρά έως μέτρια clusters, ένδειξη υψηλής γονιδιακής ενίσχυσης.H αστάθεια στο χρωμόσωμα 7 (πολυσωμία, παρατηρήθηκε ως 3-5 dots ανά πυρήνα) ανιχνεύθηκε σε 11/60 (18,33%) των περιπτώσεων, ενώ στις υπόλοιπες 49/60 (81,66%) παρουσιάστηκε φυσιολογικός διπλοειδικός τύπος.Συσχετίζοντας τον EGFR gene copies με το κεντρομερικό σήμα του Chr7, στις 13 προηγούμενες περιπτώσεις, που παρουσίαζαν 3-10 αντίγραφα γονιδίων, παρατηρήσαμε σε 10 από αυτά ότι χαρακτηρίζονταν από πολυσωμία και μόνο στα υπόλοιπα 3 ήταν απλή ενίσχυση.Στατιστική σημαντική συσχέτιση παρατηρήθηκε μεταξύ της αστάθειας του Chr7 και του σταδίου του καρκίνου (p=0.024), ενώ δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του EGFR gene και των εξεταζομένων κλινικοπαθολογοανατομικών παραμέτρων.Σαν συμπέρασμα θεωρούμε ότι διαφορετικές υποομάδες ασθενών με καρκίνο του εντέρου παρουσιάζουν ειδικές πρωτεϊνικές και γονιδιακές αλλαγές κυρίως στα EGFR , VEGF/HIF1a μόρια. Αυτό το δεδομένο μπορεί να είναι η βάση για περισσότερο ρεαλιστικές στοχευμένες θεραπείες, συνδυάζοντας την γνώση των μηχανισμών της απορρύθμισης αυτών των μορίων. Επίσης η μελέτη έδειξε μια ισχυρή συσχέτιση μεταξύ της ανευπλοϊδείας του χρωμοσώματος 7 και του μεγαλύτερου σταδίου της ασθένειας (αυξημένο p-stage).