Μελέτη των επιδράσεων των ελευθέρων ριζών στη μοριακή διαμόρφωση του κολπικού μυοκαρδίου με φασματοσκοπικές μεθόδους

Abstract

In the present work Fourier Transform Infrared Spectroscopy FT-IR in combination with Scanning Electron Microscopy (SEM-EDX) were used to study the effect of free radicals on the molecular structure of atrial myocardium.The atrial myocardium samples were collected from 55 patients, who underwent coronary bypass surgery or/and heart valve replacement. The samples were collected from 13 women and 41 men between 38-83 years old.The FT-IR revealed significant differences between the atrial myocardium, heavily calcified-stenotic or bicuspid aortic valve samples from patients with those from postmortal samples without heart disease. Differences were observed at the intensity of spectral bands and at the shift changes to other regions of the spectra as well.The increase of band intensity of stretching vibrations of vNH groups is correlated with the increase of tail NH groups, which suggest the acceptance of chain bonds fracture.The bands in the region of 2970 to 2850 cm-1, arise from antisymmetric and symmetric stretching vibrations of vCH3 and vCH2 groups of fatty acids and cholesterol esters. The intensity increase of these bands is associated with an increase of the freedom of vibrational motion of aliphatic chain of lipids, indicating a more flexible hydrophilic environment in these lipid chains. The appearance of the new bands in this region is associated with the branching of lipid fragments as a result of the interactions between free radicals and lipids.The characteristic band at 1742 cm-1, due to vCO, which is assigned to stretching vibration of carbonyl-ester or aldehydes, is a “marker band” of the progression of the disease. This band is connected with peroxidation of the biological macromolecules of membrane and shows that free radicals are involved in a pathway of the disease.The infrared absorption bands in the region 1700 cm-1 to 1500 cm-1 are attributed to bending vibrations of the amide I and amide II modes of proteins. The shifting of these bands towards shorter wavenumbers reveals that the disease influences the secondary structure of proteins by changing them from α-helix cross to β-sheet and random coil with the formation of fibrils and amyloid-like proteins. The insufficient treatment of the disease is contributing to amyloid proteins formation. The formation of amyloid proteins and fibrils is connected to the increased effluence of calcium ions, which is resulted in changes of redox potential and to destruction of the cell.The observed changes of the spectra in the region 1200-900 cm-1 conclude the increase in the formation of polyglycans (polysaccharides) in diabetic patients.Τhe SEM data showed that in aortic valves the protein-protein cross-linking bonds are the starting sites of calcification. XRD analysis demonstrates that calcium deposits in the aortic valve tissues are consistent with low crystallinity biological hydroxyapatite, (Ca10(PO4)6(OH)2), as bone formation and different calcium phosphate salts, such as dicalcium phosphate (CaHPO4) and tricalcium phosphate [Ca3(PO4)2], in agreement with IR spectroscopic data. In addition, substitution of Ca2+ cations by Mg2+ cations leads to the formation of amorphous hydroxyapatite, preventing aortic valve stenosis, which suggests that treatment with magnesium salts may reduce stenosis of aortic valves.SEM-EDX analyses of the architecture of right atrial appendix myocardium and coronary arteries showed damaged proteins, in agreement with infrared spectral data. In many patients were detected toxic metals such as led (Pb), Titanium (Ti), Chromium (Cr), Nickel (Ni), Copper (Cu), Barium (Ba), Aluminum (Al), which were associated with professional environment as well as with implants. It is known that these metals induce or amplify the oxidative stress.In conclusion, from the infrared spectral and SEM data it was suggested that oxidative stress has a potential role at the progression of the disease. The influence of oxidative stress on patients was more intense in those patients with multiple risk factors for coronary artery disease. The toxic metals which were found amplified the result of induced from oxidative stress either by producing free radicals or by reacting directly with important biological molecules. The observed lesions of the right atrial appendage are more obvious of that observed in coronary arteries. The presence at the FT-IR spectra of LDL and v(S-S) vibrational modes confirms that pre-inflammation conditions was the result of the influence of oxidative stress.

Στην παρούσα διατριβή χρησιμοποιήθηκε η υπέρυθρη φασματοσκοπία με μετασχηματισμό Fourier (Fourier Transform Infrared, FT-IR) σε συνδυασμό με την ηλεκτρονική μικροσκοπία διασποράς (SEM, scanning Electron Microscopy) για την μελέτη του ρόλου των ελευθέρων ριζών στην μοριακή διαμόρφωση του μυοκαρδίου. Τα δείγματα κολπικού μυοκαρδίου που μελετήθηκαν, λήφθηκαν από 55 ασθενείς, οι οποίοι υποβλήθηκαν σε καρδιοχειρουργική επέμβαση αορτοστεφανιαίας παράκαμψης (BYPASS), ή αντικατάσταση βαλβίδος με προσθετική ή και τα δύο. Απ’αυτούς 13 ήταν γυναίκες και 41 άνδρες και η ηλικία κυμαινόταν από 38-83 ετών. Τα υπέρυθρα φάσματα των δεξιών κολπικών ωτίων, της στενωμένης και ασβεστωμένης ή δίπτυχης εκφυλισμένης αορτικής βαλβίδας και στεφανιαίων αρτηριών, συγκρινόμενα με αντίστοιχα φάσματα υγιών ατόμων τα οποία λήφθηκαν από τράπεζα αλλά και μεταξύ τους, έδειξαν σημαντικές μεταβολές. Η αύξηση των εντάσεων των ταινιών των δονήσεων τάσεων των νΝΗ ομάδων των πρωτεϊνών συνδέθηκε με την αύξηση των τερματικών ΝΗ ομάδων, γεγονός που πραπέμπει στην παραδοχή της σχάσης των αλυσίδων. Η αύξηση των εντάσεων των ταινιών των μεθυλ και μεθυλεν ομάδων στην περιοχή 3000-2850 cm-1 συνεπάγεται την μεταβολή της διαπερατότητας και ευκινησίας των μεμβρανών. Η εμφάνιση και νέων κορυφών στην περιοχή αυτή προέρχεται από προϊόντα διακλάδωσης των αλυσίδων, ως αποτέλεσμα των σχηματιζόμενων ελευθέρων ριζών των λιπιδίων που σχηματίζουν τις μεμβράνες. Σημαντικές διαφορές παρατηρήθηκαν στην περιοχή του φάσματος μεταξύ 1800-1500 cm-1 όπου απορροφούν οι χαρακτηριστικές ομάδες amide I και amide II του πρωτεϊνών. Η μετατόπιση των μεγίστων απορρόφησης προς μικρότερους κυματαριθμούς έδειξε ότι η α-έλικα μεταβάλει την δευτεροταγή δομή και λαμβάνει διαμόρφωση τυχαίας περιέλιξης. Παράλληλα διαπιστώνεται ότι σχηματίζονται αμυλοειδούς τύπου πρωτεΐνες, όπως προκύπτει από την εμφάνιση στο φάσμα των χαρακτηριστικών ταινιών των β-παράλληλων και β-αντιπαράλληλων επιπέδων. Στον σχηματισμό αμυλοειδούς τύπου πρωτεϊνών αποδίδουμε την αδυναμία πλήρους φαρμακευτικής αντιμετώπισης της νόσου. Ο σχηματισμός αμυλοειδών πρωτεϊνών και ινιδίων συνδέεται με αυξημένη εκροή ιόντων ασβεστίου, η οποία οδηγεί σε μεταβολή του οξειδοαναγωγικού δυναμικού του κυττάρου οδηγώντας στην καταστροφή του. Η αύξηση των εντάσεων στην περιοχή του φάσματος μεταξύ 1200-900 cm-1 συνδέεται με την αυξημένη γλυκοζυλίωση του καρδιαγγειακού συστήματος των ασθενών, η οποία είναι αυξημένη στους διαβητικούς ασθενείς. Τα υπέρυθρα φάσματα της αορτικής βαλβίδας έδειξαν ότι σχηματίζονται άλατα από άμορφο φωσφορικό ασβέστιο [Ca3(PO4)2], όξινο φωσφορικό ασβέστιο [CaΗ(PO4)2], βιολογικό υδροξυαπατίτη. Στους ασθενείς στους οποίους ανιχνεύθηκε μαγνήσιο, διαπιστώθηκε ότι τα σχηματιζόμενα άλατα ασβεστίου είναι άμορφα και δεν επιτρέπουν την ανάπτυξη στένωσης. Η SEM-EDX ανάλυση της αρχιτεκτονικής των δεξιών κολπικών ωτίων και στεφανιαίων αρτηριών έδειξε την καταστροφή των πρωτεϊνών, επιβεβαιώνοντας τα ευρήματα των υπερύθρων φασμάτων. Επίσης σε αρκετούς ασθενείς διαπιστώθηκαν τοξικά μέταλλα. Από τα υπέρυθρα φάσματα και την SEM ανάλυση διαπιστώθηκε ότι το οξειδωτικό στρες πρέπει να συμμετέχει σε κάποιο από τα στάδια εξέλιξης της νόσου. Το οξειδωτικό στρες είναι περισσότερο αυξημένο σε ασθενείς με αυξημένους παράγοντες κινδύνου. Η παρουσία των τοξικών μετάλλων ενισχύει την έκφραση της βλάβης, επειδή συμβάλλουν στην παραγωγή ελευθέρων ριζών.