Μελέτη των σηματοδοτικών οδών BRAF/MEK/ERK και AKT/mTOR στη λευχαιμία εκ τριχωτών κυττάρων

Abstract

Introduction: BRAFV600E has been proven the molecular hallmark in Hairy Cell Leukemia (HCL) lymphomagenesis. ΑΚΤ/mTOR pathway plays critical role in cell proliferation, differentiation and migration and is interconnected with MAPK signalling in several points. This study investigates for the first time the potential ΑΚΤ/mTOR pathway activation in HCL and its interconnection with ΜΑΡΚ signalling, with correlation of the results to the clinicopathological and bone marrow (BM) microvascular characteristics. ΑΚΤ/mTOR and MAPK protein expression was also detected with Western blot in a limited number of cases. Moreover, BRAFV600E mutation was identified by molecular methods in BM samples, while we compared the ΑΚΤ/mTOR pathway activation in ΒΟΝΝΑ-12 cell line before and after the transfection with a BRAFV600E mutant.Methods: BRAFV600E mutant protein as well as phosphorylated (p-) ERK1/2, mTOR, p70S6K, 4E-BP1 and ΑΚΤ were immunohistochemically detected in 77 HCL cases and also by Western blot in 7 cases. Furthermore, the proteins were also immunohistochemically studied in 16 low grade Β cell lymphomas for comparison. The results were correlated with the patients’ clinicopathological characteristics, and microvascular BM features in 36 cases. 35 cases were investigated for BRAFV600E mutation by sequencing, pyrosequencing and High Resolution Melting Analysis (HRMA). ΒΟΝΝΑ-12 cell line was transfected with BRAFV600E mutant plasmid and subsequently BRAFV600E, p-ERK1/2, p-mTOR, p-p70S6K, p-4E-BP1 και p-ΑΚΤ protein levels were measured by Western blot in wild-type and BRAFV600E mutated cells before and after rapamycin treatment, while cell proliferation was determined by MTS assay.Results: All cases were positive for BRAFV600E and p-ERK1/2 proteins and most cases were also positive for p-p70S6K, p-4E-BP1 and p-ΑΚΤ (93,5%, 97,4% και 96,1% respectively). p-mTOR expression was noted only in 12,99% of the cases. Other low grade Β cell lymphomas were negative for BRAFV600E and p-ERK1/2. Western blot results were respective to immunohistochemistry results. Molecular studies identified BRAFV600E mutation in 30/35 cases. BRAFV600E protein was positively correlated with p-p70S6K nuclear expression, p-4E-BP1 cytoplasmic expression and p-ERK1/2 nuclear/cytoplasmic expression. Cytoplasmic p-ERK1/2 was correlated with p-mTOR, cytoplasmic p-p70S6K and cytoplasmic p-4E-BP1, whereas there was correlation of p-mTOR expression with all AKT/mTOR pathway proteins. p-AKT expression was related to nuclear (but not cytoplasmic) p-p70S6K expression. As far as clinicopathological and microvascular features are concerned, p-ERK1/2 was inversely correlated with haemoglobin levels and absolute platelet number (cytoplasmic expression) and positively correlated to shape factor (nuclear expression) and BRAFV600E showed inverse correlation with absolute platelet number and absolute neutrophil number. In univariate survival analysis, increased BM infiltration by hairy cells, reduced haemoglobin levels, younger age, increased p-AKT, cytoplasmic p-ERK1/2, cytoplasmic p-4E-BP1, p-mTOR and BRAFV600E expression as well as simultaneous increased expression of p-AKT/ cytoplasmic p-mTOR/ cytoplasmic p-4E-BP1 were correlated with shorter time to next treatment (TNT). The coexpression of the three molecules remains significant in multivariate survival analysis, as well as the degree of BM infiltration by hairy cells. When p-AKT, p-mTOR and p-4E-BP1 were entered separately in Cox’s model, only the latter emerged as an independent predictor of adverse prognosis. Finally, ΒΟΝΝΑ-12 cells showed increased p-ΕRΚ1/2, p-mTOR, p-p70S6K and p-4E-BP1 levels and increased proliferation after transfection with BRAFV600E mutant. The latter finding was relatively stable also after rapamycin treatment.Conclusions: .Our findings provide evidence about ΑΚΤ/mTOR pathway activation in HCL for the first time and show, through powerful correlations of the proteins that activate or are activated by mTOR and of the integral RAF-MEK-ERK proteins, the interconnection between the two pathways. Of note is that p-4E-BP1 expression, alone or in combination with p-AKT and p-mTOR expression is brought forward as an independent predictor of earlier relapse in HCL.

Εισαγωγή: Η μετάλλαξη BRAFV600E αποτελεί το προέχον γενετικό γεγονός στη λεμφωματογένεση της ΛΤΚ. Η οδός ΑΚΤ/mTOR κατέχει ρόλο κλειδί στη ρύθμιση της κυτταρικής ανάπτυξης, διαφοροποίησης και μετανάστευσης και εμφανίζει σε αρκετά σημεία διασυνδέσεις με την οδό ΜΑΡΚ. Η συμμετοχή της οδού ΑΚΤ/mTOR στη ΛΤΚ και η σύνδεσή της με την οδό ΜΑΡΚ διερευνάται για πρώτη φορά στην παρούσα μελέτη, ενώ τα αποτελέσματα συσχετίσθηκαν με τα κλινικοπαθολογοανατομικά χαρακτηριστικά και τα μικροαγγειακά ευρήματα του ΜΟ των ασθενών. Τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν με τη μέθοδο Western blot σε μικρό αριθμό περιστατικών. Ακόμη, η παρουσία της μετάλλαξης BRAFV600E ανιχνεύθηκε με μοριακές τεχνικές σε υλικό ΟΜΒ των ασθενών, ενώ έγινε σύγκριση της ενεργοποίησης της οδού ΑΚΤ/mTOR στην κυτταρική σειρά ΒΟΝΝΑ-12 πριν και μετά τη διαμόλυνση με το μεταλλαγμένο γονίδιο BRAFV600E.Υλικό και Μέθοδοι: Το μόριο BRAFV600E καθώς και τα φωσφορυλιωμένα (p-) ERK1/2, mTOR, p70S6K, 4E-BP1 και ΑΚΤ μελετήθηκαν ανοσοϊστοχημικά σε 77 περιστατικά ΛΤΚ και με Western blot σε 7 εξ αυτών. Επίσης, τα παραπάνω μόρια μελετήθηκαν σε 16 περιστατικά άλλων Β λεμφωμάτων χαμηλής κακοήθειας για σύγκριση των αποτελεσμάτων. Τα αποτελέσματα συσχετίσθηκαν με τα κλινικοπαθολογοανατομικά χαρακτηριστικά των ασθενών, και τα μικροαγγειακά ευρήματα του ΜΟ των ασθενών σε 36 εξ αυτών. Έγινε έλεγχος για την μετάλλαξη BRAFV600E με αλληλούχιση, πυροαλληλούχιση και ανάλυση τήξης υψηλής ευκρίνειας σε 35 περιστατικά. Η κυτταρική σειρά ΛΤΚ ΒΟΝΝΑ-12 διαμολύνθηκε με πλασμίδιο το οποίο έφερε τη μετάλλαξη BRAFV600E και στη συνέχεια προσδιορίστηκαν τα επίπεδα των πρωτεϊνών BRAFV600E, p-ERK1/2, p-mTOR, p-p70S6K, p-4E-BP1 και p-ΑΚΤ με Western blot σε φυσικού τύπου και BRAFV600E μεταλλαγμένα κύτταρα πριν και μετά τη χορήγηση ραπαμυκίνης, ενώ έγινε και μελέτη πολλαπλασιασμού των κυττάρων με τη μέθοδο ΜΤS.Αποτελέσματα: Όλα τα περιστατικά ήταν θετικά για BRAFV600E και p-ERK1/2 και τα περισσότερα για p-p70S6K, p-4E-BP1 και p-ΑΚΤ (93,5%, 97,4% και 96,1% αντίστοιχα), ενώ έκφραση του p-mTOR παρατηρήθηκε μόνο στο 12,99% των περιπτώσεων. Τα λοιπά Β λεμφώματα χαμηλής κακοήθειας ήταν αρνητικά για τις πρωτεΐνες BRAFV600E και p-ERK1/2. Τα αποτελέσματα του Western blot είχαν αντίστοιχη εικόνα, ενώ οι μοριακές τεχνικές ανέδειξαν την παρουσία της μετάλλαξης BRAFV600E σε 30/35 περιστατικά. Η πρωτεΐνη BRAFV600E εμφάνισε θετική συσχέτιση με την πυρηνική έκφραση του p-p70S6K, την κυτταροπλασματική έκφραση του p-4E-BP1 και την πυρηνική/κυτταροπλασματική έκφραση του p-ERK1/2. Η κυτταροπλασματική έκφραση του p-ERK1/2 συσχετίσθηκε με την έκφραση του p-mTOR, την κυτταροπλασματική έκφραση του p-p70S6K και την κυτταροπλασματική έκφραση του p-4E-BP1, ενώ η έκφραση του p-mTOR εμφάνισε συσχετίσεις με όλα τα υπόλοιπα μόρια της οδού AKT/mTOR. Η έκφραση του p-AKT συσχετίσθηκε με την πυρηνική (αλλά όχι την κυτταροπλασματική) έκφραση του p-p70S6K. Όσον αφορά τα κλινικοπαθολογοανατομικά και μικροαγγειακά χαρακτηριστικά, το p-ERK1/2 έδειξε αντίστροφη συσχέτιση με τα επίπεδα αιμοσφαιρίνης και τον απόλυτο αριθμό αιμοπεταλίων (κυτταροπλασματική έκφραση) και θετική συσχέτιση με τον παράγοντα καμπυλότητας (πυρηνική έκφραση), ενώ το BRAFV600E συσχετίσθηκε αρνητικά με τον απόλυτο αριθμό των αιμοπεταλίων και τον απόλυτο αριθμό των ουδετεροφίλων. Στη μονοπαραγοντική ανάλυση επιβίωσης η αυξημένη διήθηση του ΜΟ από ΛΤΚ, τα μειωμένα επίπεδα αιμοσφαιρίνης, η νεότερη ηλικία, η αυξημένη έκφραση του p-AKT, του κυτταροπλασματικού p-ERK1/2, του κυτταροπλασματικού p-4E-BP1, του p-mTOR και του BRAFV600E όπως και η παρουσία ταυτόχρονης αυξημένης έκφρασης των πρωτεϊνών p-AKT/ κυτταροπλασματικού p-mTOR/ κυτταροπλασματικού p-4E-BP1 συσχετίσθηκαν με βραχύτερο διάστημα TNT. Η συνέκφραση αυτών των τριών μορίων παραμένει σημαντική στην πολυπαραγοντική ανάλυση επιβίωσης, όπως και ο βαθμός διήθησης του ΜΟ από ΤΚ. Όταν τα p-AKT, p-mTOR και p-4E-BP1 εισήχθησαν χωριστά στο μοντέλο Cox, μόνο το τελευταίο αναδείχθηκε ως ανεξάρτητος προγνωστικός παράγων δυσμενούς πρόγνωσης. Τέλος, τα κύτταρα ΒΟΝΝΑ-12 παρουσίασαν αυξημένα επίπεδα p-ΕRΚ1/2, p-mTOR, p-p70S6K και p-4E-BP1 και αυξημένο πολλαπλασιασμό μετά την εισαγωγή της μετάλλαξης BRAFV600E, ο οποίος ήταν σχετικά ανθεκτικός στη χορήγηση ραπαμυκίνης. Συμπεράσματα: .Τα ευρήματά μας καταδεικνύουν για πρώτη φορά την ενεργοποίηση της οδού ΑΚΤ/mTOR στη ΛΤΚ και, μέσω των ισχυρών συσχετίσεων των μορίων που ενεργοποιούν ή ενεργοποιούνται από το mTOR με τα μόρια της οδού Raf-MEK-ERK, την υπάρχουσα αλληλεπίδραση των δύο οδών. Αξιοσημείωτη είναι η ανάδειξη της έκφρασης του μορίου p-4E-BP1, μόνη της ή σε συνδυασμό με την έκφραση των p-AKT και p-mTOR ως ανεξάρτητου προγνωστικού παράγοντα βραχύτερης υποτροπής στη ΛΤΚ.