Role of diverse signaling pathways and bHLH-O proteins in neural stem cell maintenance and proliferation in Drosophila

Abstract

In developmental neuroscience, a key challenge is unraveling the molecular genetic networks underlying brain formation. Dysfunctions in these pathways can result in devastating disorders. During my Ph.D. research, utilizing Drosophila as a model, I investigated various molecular aspects of brain development and disorders arising from disruptions in molecular genetic networks. My thesis aimed to deepen our understanding of the regulatory mechanisms governing neural stem cell (NSC) maintenance and proliferation. Despite the morphological differences, the Drosophila central nervous system (CNS) employs common signaling molecules, including the well-studied Notch pathway, also crucial in mammalian nervous system development. Drosophila undergoes neurogenesis during two distinct life stages: embryonic and larval. Notably, adult fly neurogenesis has not been observed, indicating that all necessary neurons are generated during the juvenile phases. Neural stem cells (NSCs) aka neuroblasts (NBs), are multipotent stem cells, that divide asymmetrically to yield self-renewing NBs and differentiated ganglion mother cells (GMCs) or immature intermediate neural precursors (iINPs). The regulatory pathways governing Drosophila neurogenesis were explored during my research. Remarkably, mosaic analysis (disruption of molecular networks in certain cells within a tissue surrounded by normal cells) revealed that most of the signaling pathways were dispensable during postembryonic neurogenesis, with notable exceptions such as the Notch pathway, while others like the Dpp pathway or Jak/Stat showed subtle effects on NB proliferation. My investigation to investigate the role of Notch signaling in post-embryonic CNS development stemmed from earlier work in the Delidakis lab. Notch activation, particularly by constitutively active intracellular domain of Notch (Nicd), induced larval CNS hyperplasia, primarily by affecting GMCs/iINPs. Transcriptomic studies of Notch-induced hyperplastic CNSs identified key transcription factor genes as direct Notch targets, notably, Enhancer of split (E(spl)) and Deadpan (Dpn). Further characterization of Hairy/Enhancer of split (Hes) proteins, downstream effectors of Notch, revealed their crucial role in NB maintenance and proliferation. Genome-wide transcriptomic analyses highlighted a complex network of gene regulation mediated by the Notch signaling and their targets, basic helix-loop-helix ornage (bHLH-O) axis, with bHLH-O proteins repressing differentiation factors during brain development. Importantly, my findings underscored the important role of bHLH-O proteins in Notch pathway outcomes. Overall, my research demonstrates the genetically programmed nature of daughter cell proliferation in Drosophila neural lineages, with Notch/Hes signaling contributing significantly to these events. By shedding light on the mechanisms of tumor formation induced by Hes overexpression downstream of Notch signaling, my work offers insights into brain tumor phenotypes and opens avenues for drug screening using Drosophila tumor models.

Στην αναπτυξιακή νευροεπιστήμη, μια βασική πρόκληση είναι η αποκρυπτογράφηση των μοριακών γενετικών δικτύων που διέπουν τον σχηματισμό του εγκεφάλου. Δυσλειτουργίες σε αυτά τα μονοπάτια μπορούν να οδηγήσουν σε καταστροφικές διαταραχές. Κατά τη διάρκεια της διδακτορικής μου έρευνας, χρησιμοποιώντας τη Δροσόφιλα ως μοντέλο, διερεύνησα διάφορες μοριακές πτυχές της ανάπτυξης του εγκεφάλου και των διαταραχών που προκύπτουν από διαταραχές στα μοριακά γενετικά δίκτυα. Η διατριβή μου στόχευε στη βαθύτερη κατανόηση των ρυθμιστικών μηχανισμών που διέπουν τη διατήρηση και τον πολλαπλασιασμό των νευρικών βλαστικών κυττάρων (NSC). Παρά τις μορφολογικές διαφορές, το κεντρικό νευρικό σύστημα (ΚΝΣ) της Δροσόφιλας χρησιμοποιεί κοινά σηματοδοτικά μόρια, συμπεριλαμβανομένου του καλά μελετημένου μονοπατιού Notch, που είναι επίσης κρίσιμο στην ανάπτυξη του νευρικού συστήματος των θηλαστικών. Η Δροσόφιλα υφίσταται νευρογένεση κατά τη διάρκεια δύο διακριτών σταδίων ζωής: εμβρυϊκό και προνυμφικό. Αξιοσημείωτα, δεν έχει παρατηρηθεί νευρογένεση στις ενήλικες μύγες, υποδεικνύοντας ότι όλοι οι απαραίτητοι νευρώνες παράγονται κατά τις νεανικές φάσεις. Τα νευρικά βλαστικά κύτταρα (NSCs), γνωστά και ως νευροβλάστες (NBs), είναι πολυδύναμα βλαστικά κύτταρα, διαιρούνται ασύμμετρα για να παράγουν αυτο-ανανεούμενους NBs και διαφοροποιημένα μητρικά κύτταρα γαγγλίων (GMCs) ή ανώριμους ενδιάμεσους νευρικούς προδρόμους (iINPs). Τα ρυθμιστικά μονοπάτια που διέπουν τη νευρογένεση της Δροσόφιλας διερευνήθηκαν κατά τη διάρκεια της έρευνάς μου. Αξιοσημείωτα, η μωσαϊκή ανάλυση (διαταραχή των μοριακών δικτύων σε ορισμένα κύτταρα εντός ενός ιστού που περιβάλλεται από φυσιολογικά κύτταρα) αποκάλυψε ότι τα περισσότερα σηματοδοτικά μονοπάτια ήταν αναλώσιμα κατά τη διάρκεια της μετεμβρυϊκής νευρογένεσης, με αξιοσημείωτες εξαιρέσεις όπως το μονοπάτι Notch, ενώ άλλα όπως το μονοπάτι Dpp ή Jak/Stat έδειξαν ήπιες επιδράσεις στον πολλαπλασιασμό των NB. Η έρευνά μου για τη διερεύνηση του ρόλου της σηματοδότησης Notch στη μετεμβρυϊκή ανάπτυξη του ΚΝΣ προέκυψε από προηγούμενες εργασίες στο εργαστήριο Delidakis. Η ενεργοποίηση του Notch, ιδιαίτερα από το συνεχώς ενεργό ενδοκυτταρικό τμήμα του Notch (Nicd), προκάλεσε υπερπλασία του προνυμφικού ΚΝΣ, κυρίως επηρεάζοντας τα GMCs/iINPs. Μεταγραφικές μελέτες των υπερπλαστικών ΚΝΣ που επάγονται από το Notch εντόπισαν βασικά γονίδια μεταγραφικών παραγόντων ως άμεσους στόχους του Notch, ιδιαίτερα το Enhancer of split (E(spl)) και το Deadpan (Dpn). Περαιτέρω χαρακτηρισμός των πρωτεϊνών Hairy/Enhancer of split (Hes), καθοδικών τελεστών του Notch, αποκάλυψε τον κρίσιμο ρόλο τους στη διατήρηση και τον πολλαπλασιασμό των NB. Αναλύσεις μεταγραφικού προφίλ σε επίπεδο γονιδιώματος ανέδειξαν ένα πολύπλοκο δίκτυο γονιδιακής ρύθμισης που διαμεσολαβείται από τον άξονα σηματοδότησης Notch και τους στόχους τους basic helix-loop-helix orange (bHLH-O), με τις πρωτεΐνες bHLH-O να καταστέλλουν παράγοντες διαφοροποίησης κατά την ανάπτυξη του εγκεφάλου. Σημαντικά, τα ευρήματά μου υπογράμμισαν τον σημαντικό ρόλο των πρωτεϊνών bHLH-O στα αποτελέσματα του μονοπατιού Notch. Συνολικά, η έρευνά μου αποδεικνύει τη γενετικά προγραμματισμένη φύση του πολλαπλασιασμού των θυγατρικών κυττάρων στις νευρικές σειρές της Δροσόφιλας, με τη σηματοδότηση Notch/Hes να συμβάλλει σημαντικά σε αυτά τα γεγονότα. Ρίχνοντας φως στους μηχανισμούς σχηματισμού όγκων που επάγονται από την υπερέκφραση των Hes καθοδικά της σηματοδότησης Notch, η εργασία μου προσφέρει γνώσεις για τους φαινοτύπους των όγκων του εγκεφάλου και ανοίγει δρόμους για τον έλεγχο φαρμάκων χρησιμοποιώντας μοντέλα όγκων της Δροσόφιλας.