Μηχανιστική ενζυμολογία: εφαρμογές στην παραγωγή βιοκαυσίμου

Abstract

Biofuels are the most favorable alternative source of fuels. Thus, the aim of this thesis was to study the reactions and mechanisms of enzymatic esterification by hydrolases (KM-IFO-0288-A, CALB, LipA), targeting to the production of biofuel through esterification reactions of fatty acids derived from the oxygenation of residues from the beverage industries (Mixture A) with ethanol and 1-butanol at high yields and ester concentrations so that to make this production economically viable and sustainable with the ultimate goal of gradual self-sufficiency from fossil fuels. In order to achieve the above objectives, protocols of kinetic methodologies were employed, such as proton inventories (P.I.), calculation of the solvent isotope effect (S.I.E.) and kinetic isotope effect (K.I.E.), response surface methodology (RSM), and multi criteria decision analysis (MCDA).Consequently, for the KM-IFO-0288-A protease a full characterization was performed based on a new experimental sequence (P.I., pH and absolute temperature profiles in systems of increasing ionic strength, as well as P.I. in a broad pH range where the used hydrolase was active) in order to further investigate its mechanism and appropriateness for use in non-conventional reaction media. Then, immobilization of the KM-IFO-0288-A protease was achieved, followed by esterification reactions with Mixture A and ethanol, in anhydrous solvent-free reaction environment targeting to biofuel production catalyzed by KM-IFO-0288-A protease.Subsequently and by using the enzymes, immobilized lipase B, from Candida antarctica (CALB), and immobilized lipase A, from B. subtilis (LipA), a series of esterifications of Mixture A were performed with ethanol and 1-butanol, in anhydrous n-hexane as solvent. Throughout these esterification reactions the following were applied: (a) the methodology of response surfaces to optimize the responses in % yield and the total ester concentration, in the esterification reaction mixture, and (b) the total solution of each operated experimental design by the multiple criteria decision analysis (MCDA). It followed a kinetic study of the enzymatic reaction of esterification of butyric acid with ethanol and deuterated ethanol with CALB, in anhydrous n-hexane solvent, as well as the estimation of K.I.E.As conclusions emerged, from the previous experimental processes, firstly the development of a new methodology that allows the investigation of the mechanisms of action and the dynamic behavior of enzymes. In particular, it was found that: (a) the isotopic fractionation factors ΦT are referred to the transferred protons from the catalytic residues, (b) a pH-dependent conversion of the referred ΦT hydrogen bonds to LBHB (low barrier hydrogen bonds) results an increase of nucleophilicity of catalytic S, and (c) conversion of some areas of protease’s structure in areas of increased flexibility facilitating catalysis and depending on both the pH value and the ionic strength of the reaction mixture.Thereafter, an integrated and cost-effective process was developed by which a pervaporation membrane reactor (it was investigated the beneficial contribution of the removal of the produced H2O from the reaction mixture) produced a new generation biofuel which reached a yield of 97.4% in 16 hours and at ester concentration of 3.35 M, representing an increase of about 500% relative to previous reports.Another important conclusion was the best fitting of the kinetic data (firstly in enzyme kinetic studies) by surface equations, where the parameters of the existing esterification mechanism were determined more reliably, irrespectively of the concentrations of the used substrates. Thus, as well as by the application of the technique of K.I.E., it has been shown that ping-pong bi-bi type kinetics are followed during the abovementioned esterification reactions, which are inhibited by both substrates.

Τα βιοκαύσιμα αποτελούν την ευνοϊκότερη επιλογή εναλλακτικής πηγής καυσίμων. Έτσι, σκοπός της παρούσης διατριβής ήταν η μελέτη αντιδράσεων και μηχανισμών ενζυμικής εστεροποίησης με υδρολάσες (ΚΜ-IFO-0288-Α, CALB, LipA), που ως τελικό στόχο είχε την παραγωγή βιοκαυσίμου, μέσω αντιδράσεων εστεροποίησης λιπαρών οξέων προερχόμενων από οξυγένεση υπολειμμάτων βιομηχανιών ποτοποιίας (Μίγμα Α), με αιθανόλη και 1-βουτανόλη, σε υψηλές % αποδόσεις και συγκεντρώσεις εστέρα ώστε μια τέτοια παραγωγή να καταστεί οικονομικά συμφέρουσα και βιώσιμη με απώτερο σκοπό την σταδιακή απεξάρτηση από τα ορυκτά καύσιμα. Για την επίτευξη των παραπάνω σκοπών και στόχων χρησιμοποιηθήκαν δόκιμες κινητικές μεθοδολογίες, όπως η καταμέτρηση πρωτονίων (P.I.), ο υπολογισμός του ισοτοπικού φαινόμενου διαλύτη (S.I.E.) και του κινητικού ισοτοπικού φαινόμενου (K.I.E.), η μεθοδολογία των αποκριτικών επιφανειών (RSM), καθώς και η ανάλυση πολλαπλών κριτηρίων λήψης αποφάσεων (MCDA).Έτσι, για την πρωτεάση ΚΜ-IFO-0288-Α, πραγματοποιήθηκε ένας πλήρης χαρακτηρισμός βασισμένος σε μία νέα αλληλουχία πειραμάτων (διαγράμματα τιμών P.I., pH και απόλυτης θερμοκρασίας σε συστήματα αυξανόμενης ιονικής ισχύος, καθώς και P.I. σε ένα ικανό εύρος τιμών pH, όπου αυτή η υδρολάση ήταν δραστική) με σκοπό την περεταίρω διερεύνηση του μηχανισμού της αλλά και της καταλληλόλητάς της για χρήση σε μη συμβατικά μέσα αντίδρασης. Ακολούθησε ακινητοποίηση της πρωτεάσης ΚΜ-IFO-0288-Α, καθώς και αντιδράσεις εστεροποίησης με Μίγμα Α και αιθανόλη, σε σύστημα χωρίς διαλύτη (άνυδρες συνθήκες), για παραγωγή βιοκαυσίμου, καταλυόμενες από την πρωτεάση ΚΜ-IFO-0288-Α.Στην συνέχεια με χρήση των ενζύμων ακινητοποιημένη λιπάση Β από Candida antarctica (CALB) και ακινητοποιημένη λιπάση-Α από Β. subtilis (LipA) πραγματοποιήθηκε μια σειρά εστεροποιήσεων του Μίγματος Α με αιθανόλη και 1-βουτανόλη, σε διαλύτη άνυδρο κ-εξάνιο Σε αυτές τις εστεροποιήσεις εφαρμόστηκαν: (α) η μεθοδολογία των αποκριτικών επιφανειών, για την βελτιστοποίηση των αποκρίσεων σε % απόδοση και ολική συγκέντρωση εστέρα στο μίγμα της αντίδρασης εστεροποίησης και (β) ολική λύση κάθε εφαρμοσθέντος πειραματικού σχεδιασμού μέσω της ανάλυσης πολλαπλών κριτηρίων λήψης αποφάσεων (MCDA). Ακολούθησε κινητική μελέτη της ενζυμικής αντίδρασης εστεροποίησης βουτυρικού οξέος με αιθανόλη και δευτεριωμένη αιθανόλη με CALB, σε διαλύτη άνυδρο κ-εξάνιο, καθώς και υπολογισμός του K.I.E. της κάθε παραμέτρου.Ως συμπεράσματα, από τις προηγούμενες πειραματικές διαδικασίες, προέκυψε αρχικά η ανάπτυξη μίας νέας μεθοδολογίας που επιτρέπει την διερεύνηση των μηχανισμών δράσης και της δυναμικής συμπεριφοράς ενζύμων. Συγκεκριμένα, προσδιορίστηκε ότι: (α) οι ισοτοπικοί παράγοντες κλασμάτωσης ΦT αναφέρονται στα μεταφερόμενα πρωτόνια των καταλυτικών καταλοίπων, (β) η pH-εξαρτώμενη μετατροπή των δεσμών υδρογόνου, στους οποίους αναφέρεται ο ΦT, σε LBHB (δεσμοί υδρογόνου χαμηλού φράγματος), έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση της πυρηνοφιλίας της καταλυτικής S (γ) η μετατροπή περιοχών της πρωτεάσης σε περιοχές αυξημένης ευπλασίας (IDPRs), που εξαρτώνται τόσο από την τιμή pH όσο και από την ιονική ισχύ του μίγματος της αντίδρασης.Στην συνέχεια αναπτύχθηκε μια ολοκληρωμένη και οικονομικά αποδοτική διεργασία μέσω της οποίας σε αντιδραστήρα μεμβράνης υπερεξάτμισης (διερευνήθηκε η ευεργετική συμβολή της απομάκρυνσης του παραγόμενου Η2Ο από το μίγμα της αντίδρασης) πραγματοποιήθηκε παραγωγή βιοκαυσίμου νέας γενιάς η οποία έφθασε σε απόδοση 97.4 % σε 16 ώρες και σε συγκέντρωση εστέρα 3.35 Μ, γεγονός που συνιστά αύξηση περίπου 500 % σε σχέση με προηγούμενες αναφορές.Ένα ακόμη σημαντικό συμπέρασμα προέκυψε από την προσαρμογή των κινητικών δεδομένων (για πρώτη φορά σε μελέτες ενζυμικής κινητικής) με εξισώσεις επιφάνειας, όπου προσδιορίστηκαν πιο αξιόπιστα οι παράμετροι του ισχύοντος μηχανισμού εστεροποίησης, ανεξάρτητα από τις συγκεντρώσεις των χρησιμοποιούμενων υποστρωμάτων. Έτσι, καθώς και με την εφαρμογή της τεχνικής του Κ.Ι.Ε. αποδείχτηκε ότι ακολουθείται κινητική συστήματος τύπου ping-pong bi-bi με αναστολή και από τα δύο υποστρώματα.