Ανοσοϊστοχημική μελέτη της έκφρασης της κινάσης ERK2 και των πρωτεϊνών των μεταγραφικών παραγόντων ETS-1 και φωσφορυλιωμένης STAT-1 σε διηθητικά καρκινώματα του μαστού

Abstract

Introduction: Mitogen-activated protein kinase (MAP kinase) pathways represent a cascade of phosphorylation events, including three pivotal kinases, Raf, MEK and ERK2, which have been implicated in the pathogenesis of cancer. The aim of the present study was to investigate the expression of ERK2 kinase and its target proteins ETS-1 and phosphorylated STAT-1 in invasive breast carcinomas and their correlation with classic clinicopathological parameters and patients’ survival. ETS-1 is a transcription factor, implicated in the regulation of expression of various genes. STAT-1 is the first member of signal transducers and activators of transcription (STATs). Recent studies have demonstrated its apoptotic and anti-proliferative effect in breast cancer experimental models, therefore suggesting a tumor suppressor role.Methods: Immunohistochemistry was performed in paraffin-embedded tissue specimens from 151 invasive breast carcinomas to detect the expression of ERK2, ETS-1 and pSTAT-1 with clinicopathological parameters and patients’ survival. There was insufficient material for the detection of expression of ETS-1 protein for 2 patients. The results were statistically processed using univariate analysis (Pearson’s-chi-square test) and multivariate analysis (logistic regression or Cox proportional hazard regression model). Overall and disease-free survival distribution curves were assessed by Kaplan-Meier test and log rank statistics.Results: ERK2 immunoexpression was detected in the cytoplasm and nucleus ofcancer cells in 37.7% and 19.2% of cases, respectively. Nuclear ERK2 was inversely correlated with ER (p=0.039), whereas cytoplasmic ERK2 was more often expressed in lobular than ductal carcinomas (p=0.026). Nuclear ERK2 expression was found to be an independent prognostic factor of shortened overall survival of patients (p=0.040), while cytoplasmic ERK2 had an independent, favorable effect on both disease-free and overall survival (p<0.0001 and p=0.002, respectively). ETS-1 protein was detected in 77.9% of the cases in the cytoplasm, in 46.3% in the nucleus of the malignant cells, and in stromal fibroblasts as well. Cytoplasmic ETS-1 was inversely correlated with nuclear and histologic grade of the tumor (p=0.004 and 0.033, respectively). Stromal ETS-1 revealed a negative correlation with estrogen receptors (ER) (p=0.003) The univariate statistic analysis showed nuclear ETS-1 to be related to a shortened overall survival of the postmenopausal patients (p=0.032). pSTAT-1 protein was immunodetected in the cytoplasm and nuclei of the malignant cells (11.6% and 8.6% respectively). In premenopausal patients, cytoplasmic pSTAT-1 expression was positively correlated with stage (p=0.014) and ER (p=0.008). Univariate analysis showed that cytoplasmic pSTAT-1, in premenopausal patients, was associated with poor overall survival (p=0.048) and the phenotype of STAT-1/ER or STAT-1/PR co-expression was associated with shorter disease-free survival (p=0.012). On the contrary, in postmenopausal patients no association with clinicopathologic parameters and survival was observed, expect for the relation of pSTAT-1/ER or STAT-1/PR co-expression with longer disease-free survival (p=0.034).Conclusion: Τhe present study for the first time indicates that the ERK2 kinase, ETS-1 protein and pSTAT-1 protein signaling pathway has a distinctive role in women with breast cancer. Specifically, compartmentalization of ERK2, as revealed by its immunodetection in the cytoplasm and nuclei of breast cancer cells, reflects a different effect on patient survival, with nuclear ERK2 being prognostic of a shortened overall survival and cytoplasmic localization being an independent favorable prognosticator of both disease-free and overall survival. In addition, ETS-1 seems to be related to a different tumor phenotype according to its topographic distribution, with nuclear localization being associated with decreased cumulative survival in postmenopausal women. Furthermore, our results suggest that pSTAT-1 is related to tumor progression in premenopausal patients through the advanced stage and decreased cumulative survival. Hence, further investigation of the ERK2 kinase, ETS-1 protein and pSTAT-1 protein signaling pathway might be crucial for exploring new therapy targets.

ΕΙΣΑΓΩΓΗ. Η ΕRK2 κινάση (Extracellular signal-regulated kinase 2) ανήκει στο σύστημα των κινασών ΜAPK (Mitogen Activated Protein Kinases). Οι ΜAPK βρίσκονται ενδοκυττάρια στο κυτταρόπλασμα και ενεργοποιούνται μετά από διέγερση υποδοχέων (υποδοχέων τύπου τυροσινικής κινάσης, υποδοχέων που συνδέονται με G-πρωτεΐνη, ιντεγκρινών και διαύλων ασβεστίου) από εξωγενή ερεθίσματα. Μετά την ενεργοποίηση τους προκαλούν φωσφορυλίωση διαφόρων ουσιών, είτε στον πυρήνα είτε στο κυτταρόπλασμα, και ρυθμίζουν έτσι κυτταρικές δραστηριότητες όπως γονιδιακή έκφραση, μίτωση, κίνηση, μεταβολισμό και προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο και έχουν εμπλακεί στην παθογένεση του καρκίνου. Στους στόχους της κινάσης ΕRK2 μέσω της μεταγραφής των αντίστοιχων γονιδίων ανήκει η ETS-1 πρωτεΐνη και η φωσφορυλιωμένη πρωτεΐνη STAT-1 (pSTAT-1). Η ETS-1 πρωτεΐνη ανήκει στην οικογένεια των ΕΤS μεταγραφικών παραγόντων η οποία παίζει κύριο ρυθμιστικό ρόλο στην ανάπτυξη και ογκογένεση. Οι ETS πρωτεΐνες προσδένονται στους υποκινητές των γονιδίων στόχων τους και ενεργοποιούν την μεταγραφή τους. Η pSTAT-1 είναι το πρώτο μέλος της οικογένειας των STAT μεταγραφικών παραγόντων. Πρόσφατες μελέτες έχουν υποδείξει ότι επάγει την απόπτωση και αναστέλλει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό σε πειραματικά μοντέλα καρκίνου του μαστού. Η προγνωστική σημασία της ανοσοϊστοχημικής έκφρασης της ERK2 κινάσης και των ETS-1 και pSTAT-1 σε ασθενείς με καρκίνο του μαστού παραμένει αδιευκρίνιστη. Σκοπός της διδακτορικής αυτής διατριβής ήταν η διερεύνηση της έκφρασης της ERK2 κινάσης και της έκφρασης των πρωτεϊνών ETS-1 και pSTAT-1 σε ασθενείς με καρκίνο του μαστού. ΜΕΘΟΔΟΙ. Ανοσοϊστοχημική μέθοδος τριών βημάτων εφαρμόσθηκε σε τομές παραφίνης από 151 ασθενείς με διηθητικό καρκίνο μαστού με στόχο την εντόπιση της ERK2 κινάσης, της ETS-1 πρωτεΐνης και της pSTAT-1 και τη συσχέτιση τους με τις προγνωστικές κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους την επιβίωση των ασθενών. Δεν υπήρχε επαρκές υλικό για αξιολόγηση της έκφρασης της ETS-1 πρωτεΐνης σε 2 ασθενείς. Τα αποτελέσματα αξιολογήθηκαν με μονοπαραγοντική (Pearson’s-chi-square test) και πολυπαραγοντική στατιστική ανάλυση (μοντέλο λογιστικής παλινδρόμησης ή Cox proportional hazard regression model). Οι καμπύλες επιβίωσης προέκυψαν με δοκιμασία Kaplan-Meier και log rank στατιστική ανάλυση. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ. Η ERK2 ανιχνεύθηκε ανοσοϊστοχημικά στο κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα των καρκινικών κυττάρων σε 37.7% και 19.2% των ασθενών αντιστοίχως. Η πυρηνική εντόπιση της ERK2 συσχετίσθηκε αντιστρόφως με τους ER (p=0.053) στην μονοπαραγοντική ανάλυση και στην πολυπαραγοντική ανάλυση (p=0.039), ενώ η κυτταροπλασματική ERK2 εκφραζόταν συχνότερα σε λοβιακά παρά πορογενή καρκινώματα (p=0.026) στην πολυπαραγοντική ανάλυση. Η πυρηνική έκφραση της ERK2 βρέθηκε να είναι ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας μικρότερης ολικής επιβίωσης των ασθενών (p=0.04), ενώ η κυτταροπλασματική έκφραση της ERK2 είχε ανεξάρτητη ευνοϊκή επίδραση στην ελεύθερη νόσου επιβίωση και στην ολική επιβίωση (p<0.0001 και p=0.002, αντίστοιχα).Η ETS-1 πρωτεΐνη ανιχνεύθηκε σε 77.9% στο κυτταρόπλασμα και στο 46.3% στον πυρήνα των καρκινικών κυττάρων. Η κυτταροπλασματική έκφραση της ETS-1 συσχετιζόταν αντίστροφα με τον πυρηνικό και ιστολογικό βαθμό κακοηθείας (p= 0.004 και p=0.033, αντίστοιχα) στην μονοπαγοντική ανάλυση. Η έκφραση της ETS-1 πρωτεΐνης στο στρώμα παρουσίαζε αρνητική συσχέτιση με τους οιστρογονικούς υποδοχείς (p=0.003) στην μονοπαγοντική ανάλυση. Η μονοπαραγοντική ανάλυση έδειξε ότι η πυρηνική εντόπιση της ETS-1 σχετίζεται με μικρότερη ολική επιβίωση των μετα-εμμηνοπαυσιακών ασθενών (p =0.032).Η pSTAT-1 πρωτεΐνη ανιχνεύτηκε στο κυτταρόπλασμα και στον πυρήνα των καρκινικών κυττάρων σε ποσοστό 11,6% και 8,6%, αντίστοιχα. Στην ομάδα των προ-εμμηνοπαυσιακών ασθενών η κυτταροπλασματική pSTAT-1 συσχετίσθηκε παράλληλα με το στάδιο της νόσου (p=0.014) και την έκφραση των ER (p=0.008). Η κυτταροπλασματική pSTAT-1 είχε δυσμενή επίδραση στο διάστημα της ολικής επιβίωσης (p=0.048) στην ομάδα των προ-εμμηνοπαυσιακών ασθενών, ενώ προ-εμμηνοπαυσιακές ασθενείς με φαινότυπο ταυτόχρονης θετικής έκφρασης pSTAT-1/ ER ή PR παρουσίασαν μικρότερο διάστημα ελεύθερης νόσου επιβίωσης (p=0.012). Στην ομάδα των μετα-εμμηνοπαυσιακών ασθενών δεν παρατηρήθηκε καμία συσχέτιση με τις κλινικοπαθολογοαναντομικές παραμέτρους αλλά υπήρχε ευνοϊκή επίδραση στην ελεύθερη νόσου επιβίωση των ασθενών με το φαινότυπο ταυτόχρονης θετικής έκφρασης pSTAT-1/ ER ή PR (p=0.034). ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ. Συπερασματικά η διατριβή αυτή συνολικά αναδεικνύει ότι το μονοπάτι της κινάσης ERK2 και των πρωτεϊνών ETS-1 και pSTAT-1 έχει έναν διακριτό ρόλο όσον αφορά την πρόγνωση σε γυναίκες με διηθητικό καρκίνο του μαστού. Συγκεκριμμένα, τα ευρήματα της διατριβής υποστηρίζουν τη σημασία της διαμερισματοποίησης της ERK2, όπως αυτή αποκαλύπτεται από την ανοσοϊστοχημική ανίχνευση της στο κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα των καρκινικών κυττάρων του μαστού. Η πυρηνική εντόπιση της ERK2 σχετίζεται με μικρότερη ολική επιβίωση και η κυτταροπλασματική έκφραση της ERK2 με καλύτερη πρόγνωση των ασθενών. Η πυρηνική έκφραση της ETS-1 πρωτεΐνης σχετίζεται με μειωμένη ολική επιβίωση των μετα-εμμηνοπαυσιακών γυναικών. Όσον αφορά την έκφραση της pSTAT-1 η κυτταροπλασματική εντόπιση της σχετίσθηκε με μικρότερη ολική επιβίωση στις προ-εμμηνοπαυσιακές γυναίκες. Η πυρηνική έκφραση των πρωτεϊνών ERK2 και ETS-1 η δε κυτταροπλασματική της pSTAT-1 στα καρκινικά κύτταρα συσχετίσθηκε με δυσμενή πρόγνωση των ασθενών και ως εκ τούτου μπορούν να θεωρηθούν ως προγνωστικοί παράγοντες. Το γεγονός της έκφρασης της ERK2 και της ETS-1 στους πυρήνες των καρκινικών κυττάρων της δε pSTAT-1 στο κυτταρόπλασμα υποδηλώνουν σε συνδυασμό με το ανωτέρω εύρημα ότι η ενεργοποίηση γίνεται στους πυρήνες και το κυτταρόπλασμα αντίστοιχα. Αξίζει να αναφερθεί ότι τα ανωτέρω ευρήματα σχολιάζονται για πρώτη φορά στη διεθνή βιβλιογραφία. Περισσότερες μελέτες είναι απαραίτητες προς την πλήρη διαλεύκανση της σημασίας του μονοπατιού της ERK2 και των πρωτεϊνών ETS-1 και pSTAT-1 στον διηθητικό καρκίνο του μαστού και την αναζήτηση πιθανών θεραπευτικών παρεμβάσεων σε αυτό.