Μελέτη της παθογενετικής δράσης αυτοαντισωμάτων σε νόσους του κεντρικού νευρικού συστήματος

Abstract

Various research studies over the past few years have solidified the view that a growing group of neurological disorders are mediated by autoantibodies against membrane and intracellular proteins of the central nervous system (CNS). Indeed, an increasing number of patients are diagnosed with autoimmune CNS disorders which previously were considered to be idiopathic or even psychiatric. In the present study, we focused on a group of rare autoimmune disorders of the CNS, namely Stiff Person Syndrome (SPS), cerebellar ataxia and limbic encephalitis.Groups of patients suffering from these disorders harbor high titers of antibodies against γ-aminobutyric decarboxylase (GAD65). This enzyme catalyzes the decarboxylation of L-glutamic to γ-aminobutyric acid (GABA), the most common inhibitory neurotransmitter of the brain. Low titers of these autoantibodies are also found in diabetes type I. It is still unclear whether anti-GAD65 antibodies are pathogenic or markers of these disorders. Do they have different epitope specificities through which they manifest a distinct role among different clinical diseases? And if they are diagnostic markers, are there autoantigens that haven’t been identified yet? To address these questions, we used a luminescence immunoprecipitation system (LIPS), in order to determine the major GAD65 epitopes that are recognized in these disorders. We used 9 GAD-positive patients with concurrence of either cerebellar ataxia or downbeat nystagmus or stiff limp, 8 GAD-positive patients with concurrence of epilepsy and 4 patients with autoimmune encephalitis and autoimmune epilepsy. 6 SPS patients were used as positive controls. All patient sera were also screened for new autoantibodies by means of live staining in primary hippocampal neurons.In addition, we screened patients with cerebellar ataxia and SPS for new autoantibodies using live staining in primary hippocampal neurons and sera immunoprecipitations. 85 patients with cerebellum signs and 5 patients with anti-GAD65 antibodies and cerebellar ataxia were screened. To identify new autoantibodies in SPS, we used 66 sera with high titers of anti-GAD65 antibodies.Our results demonstrated that all patient sera recognized the same epitopes of the GAD65 enzyme, which support the view that anti-GAD antibodies may not be pathogenic. We also found three patients with epilepsy may harbor new autoantigens. Although we have not yet identified these antibodies nor did we identify any in the SPS syndrome, we recognized antibodies against 1,4,5-triposphate inositol receptor I (IP3R1) in patients with cerebellar ataxia. It should be noticed, that for the first time these antibodies were found in patients with co-morbidities such as multiple sclerosis (1 patient) and an underlying neurodegenerative disorder (2 patients). It should be interesting in the future to screen more patients with neurodegenerative disorders in order to unravel the role of anti-IP3R1 antibodies.

Έρευνες των τελευταίων χρόνων έχουν οδηγήσει στην περαιτέρω τεκμηρίωση ότι αυξανόμενος αριθμός νευρολογικών νόσων προκαλούνται από αυτοαντισώματα έναντι συναπτικών πρωτεϊνών του κεντρικού νευρικού συστήματος (ΚΝΣ), είτε επιφανείας είτε ενδοκυττάριων. Στην παρούσα μελέτη επικεντρωθήκαμε σε μία ομάδα σπάνιων αυτοάνοσων συνδρόμων του ΚΝΣ, συγκεκριμένα το σύνδρομο του δύσκαμπτου ανθρώπου (Stiff Person Syndrome, SPS), την παρεγκεφαλιδική αταξία και την μεταιχμιακή εγκεφαλίτιδα.Αρχικά μελετήσαμε τα αντισώματα έναντι της γ-αμινοβουτυρικής αποκαρβοξυλάσης (GAD65), που ανευρίσκονται σε αυτήν την ομάδα αυτοανόσων συνδρόμων σε υψηλούς τίτλους. Το ένζυμο αυτό καταλύει την αποκαρβοξυλίωση του L- γλουταμινικού σε γ- αμινοβουτυρικό οξύ (GABA), έναν από τους σημαντικότερους ανασταλτικούς νευροδιαβιβαστές του κεντρικού νευρικού συστήματος. Χαμηλοί τίτλοι των αντι-GAD65 αντισωμάτων ανευρίσκονται επίσης στον διαβήτη τύπου Ι. Γιατί όμως τόσο διαφορετικές κλινικές οντότητες εμφανίζουν τα ίδια αυτοαντισώματα; Η διαφορετική κλινική εκδήλωση οφείλεται στους επιτόπους που αυτά αναγνωρίζουν ή μήπως τελικά είναι απλοί βιοδείκτες; Και εάν είναι τελικά βιοδείκτες μήπως τελικά η παθογένεση οφείλεται σε κάποιο άγνωστο ακόμα αυτοαντίσωμα;Για να διερευνηθούν αυτά τα ερωτήματα αρχικά χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος LIPS (Luminescence Immunoprecipitation System), ώστε να γίνει χαρτογράφηση των επιτόπων που τα αντι-GAD65 αντισώματα αναγνωρίζουν στα ετερογενή νευρολογικά σύνδρομα. Η μέθοδος αυτή επιλέχθηκε για τα πλεονεκτήματα που παρουσιάζει έναντι άλλων τεχνικών και κυρίως γιατί δίνει τη δυνατότητα της ανίχνευσης δομικών επιτόπων των αυτοαντισωμάτων σε αντίθεση με άλλες μεθόδους όπως της ELISA. Επιπλέον, επειδή οι πρωτεΐνες-αντιγόνα εκφράζονται σε κύτταρα θηλαστικών υποβάλλονται σε όλες τις μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις που δεν επιτυγχάνονται όταν εκφράζονται in vitro.Για τα συγκεκριμένα πειράματα χρησιμοποιήθηκαν 9 GAD θετικοί ασθενείς που παρουσίαζαν επιπλέον είτε παρεγκεφαλιδική αταξία είτε κάθετο νυσταγμό είτε δύσκαμπτο άκρο, 8 GAD θετικοί ασθενείς με επιληψία και 4 ασθενείς με αυτοάνοση εγκεφαλίτιδα και αυτοάνοση επιληψία. Ως θετικά δείγματα ελέγχου χρησιμοποιήθηκαν 6 οροί τυπικών SPS ασθενών. Τέλος, οι οροί διερευνήθηκαν και για την ύπαρξη άγνωστων αυτοαντισωμάτων με χρώση ανοσοφθορισμού σε πρωτογενείς καλλιέργειες ιπποκάμπου.Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε ενδελεχής έλεγχος για την ύπαρξη άγνωστων αυτοαντισωμάτων στην παρεγκεφαλιδική αταξία και το SPS. Για την ταυτοποίηση αγνώστων αυτοαντιγόνων χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος της ανοσοκατακρήμνισης με την χρήση των προς διερεύνηση ορών. Για την διερεύνηση νέων αντισωμάτων στην παρεγκεφαλιδική αταξία χρησιμοποιήθηκαν αρχικά 85 ασθενείς με ιστορικό ευρημάτων στην παρεγκεφαλίδα και 5 ασθενείς με παρεγκεφαλιδική αταξία, οι οποίοι επιπλέον εμφάνιζαν υψηλό τίτλο αντι-GAD65 αντισωμάτων. Για την διερεύνηση νέων αντισωμάτων στο SPS χρησιμοποιήθηκαν 66 οροί ασθενών με κύριο νόσημα το SPS και υψηλό τίτλο αντι-GAD65+ αντισωμάτων.Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης κατέδειξαν ότι τα αντι-GAD65 αντισώματα δεν διαφέρουν στους επιτόπους που αυτά αναγνωρίζουν στις αυτοάνοσες νευρολογικές νόσους με τις οποίες υπάρχει ισχυρή συσχέτιση. Η παρούσα διατριβή δείχνει ότι τα αντισώματα αυτά πιθανότατα δεν διαδραματίζουν κάποιο παθογενετικό ρόλο στην εμφάνιση αυτών των νόσων, αλλά είναι απλοί διαγνωστικοί βιοδείκτες. Παρόλο που στο SPS σύνδρομο δεν ταυτοποιήθηκε κάποιο επιπλέον αντίσωμα, στην αυτοάνοση επιληψία αναγνωρίστηκαν επιπλέον μεμβρανικά αυτοαντιγόνα που μένουν να ταυτοποιηθούν. Σε ασθενείς με παρεγκεφαλιδική αταξία ταυτοποιήθηκαν αντισώματα έναντι του 1,4,5-τριφωσφορικού υποδοχέα 1 της ινοσιτόλης (IP3R1) σε ασθενείς με συννοσηρότητα πολλαπλής σκλήρυνσης (1 ασθενής) και νευροεκφυλιστικών νοσημάτων (2 ασθενείς).