Ο ρόλος των μεταλλοπρωτεϊνασών-2 και -9 στην αθηροσκλήρωση των ασθενών με χρόνια νεφρική νόσο

Abstract

Cardiovascular disease is the major cause of morbidity and mortality among patients with chronic kidney disease (CKD) especially in end-stage renal disease (ESRD). CKD is recognized by the presence of persistent proteinuria or renal dysfunction and several recent studies have reported that proteinuria is not just a marker of CKD, but that it could also cause renal damage in patients with CKD. Further, there is accumulating evidence that proteinuria is an independent risk factor for cardiovascular disease (CVD) as well. These observations suggest the link of proteinuria to CKD and CVD. However, the underlying mechanisms by which proteinuria could cause renal and vascular damage in patients with CKD are not yet well investigated.Diabetic nephropathy (DN) and primary chronic glomerulonephritis (CGN) represent the most important causes of ESRD but the exact underlying mechanisms of their pathogenesis and progression are not completely elucidated. The histological changes including glomerular hypertrophy, glomerular basement membrane (GBM) thickening and mesangial expansion, involve the remodeling of the extracellular matrix (ECM).The major physiologic regulators of ECM degradation are matrix metalloproteinases (MMPs). Collagen type-IV (col-IV) is the main collagenous component of ECM that constitutes the architectural structure of the vessel basement membrane (BM) and the GBM. BM is the part of ECM which is associated with the vascular endothelium. Both MMPs-2 and -9 are the main enzymes that degrade col-IV and they have recently been involved in atherosclerosis, as well as in CVD and CKD.Until the protocol design of this thesis there were only very few clinical data with inconsistent and controversial results from previous clinical studies correlating both MMP-2 and MMP-9 with atherosclerosis and especially in CKD while the studies included patients in advanced and end-stage of CKD. There were no data found evaluating the correlation of MMPs -2 and -9 with proteinuria. The only study correlation of MMP-2 with albuminuria, even recent time presentation with the beginning of the present study, included patients of advanced stages of CKD with various causes of the disease, and many of them didn’t present proteinuria.In this context, the primary aim of the present doctoral thesis was to investigate the involvement of MMPs -2 and -9 in the pathophysiological mechanisms linking albuminuria to atherosclerosis (carotid and femoral arteries) in CKD. Thus, atherosclerosis was examined by its early marker of IMT (intima-media thickness), the presence of atherosclerotic plaque and the result of ATHUS (atherosclerotic ultrasonic score) for all four vessels (ATHUS: 0-8, IMT <0.8mm = 0, ΙΜΤ≥0.8 = 1, absence of atherosclerotic plaque = 0 and presence of stenotic atherosclerotic plaque >25% = 1).Secondary aims of this study were to correlate those two gelatinases, MMPs -2 and -9 with hypertension (HT), body mass index (BMI), hyperuricemia biomarkers of malnutrition, inflammatory biomarkers, oxidative stress. MMPs -2 and -9 were also correlated with growth factors as TGF-β1 and VEGF-A in order to highlight another mechanism of pathogenesis and progression of CKD, which may affect the quality of life of these patients.In the present study, 160 patients of early and advanced stages of CKD were included, and 66 patients of 4th and ESRD, without being integrated into the haemodialysis program (GFR: 12-25 ml/min/1.73m2). All patients were divided into two groups according to the cause of CKD. Thus, 80 patients presented with DN from diabetes mellitus type 2 (DM2), 20 in each stage of CKD (I-IV) and 80 patients were presented with CGN (20 in each stage I-IV) including minimal change GN (MCGN), mesangioproliferative GN (MPGN), IgAN, membranous GN (MGN), and focal segmental GN (FSGN). As controls there were 112 persons divided into two groups, 56 patients with diabetes melitus type 2, without CKD, suffering from DM for more than 15 years, and 56 healthy individuals volunteers who didn’t receive any medication. Similarly were divided the other 66 patients, of advanced stages of CKD and ESRD, 33 with DN from DM2 and 33 with CGN. Thus, we tested the problem of proteinuria by two different pathways, a non-inflammatory cause of CKD (DN) and an inflammatory cause (CGN), and from the early stages of CKD advancing to the progression of the disease. A group of 44 patients who were hospitalized and attended for temporal arteritis and were negative for the disease, served as controls. The above patient and control groups were performed three different laboratory methods in order to clarify the role of both MMPs -2 and -9 in atherosclerosis and albuminuria in CKD. In the first case were determined the serum levels of MMPs -2 and -9 with their inhibitors TIMPs-1 and -2 by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the whole of 160 patients. Then in these patients was conducted genotypic analysis for five single nucleotide polymorphisms (SNPs), three of MMP-2 (C735T, C1306T, G1575A) and two of MMP-9 (R279Q, C1562T) by the technique of polymerase chain reaction (PCR). All MMPs -2 and -9 SNPs were genotyped (genomic DNA was extracted from whole blood from those patients) with the KASPar method by buying services from KBioscience company. Finally, for the 66 patients of predialysis stage, during the process of arteriovenous fistula (AVF) creation sections of the radial artery were harvested for histological and immunohistochemical examination. The expression of MMP-2, MMP-9, TIMP-1 and TIMP-2 of all types of vascular cells (endothelial-ECs, smooth muscle cells-SMCs, fibroblasts-FBCs) was measured using immunohistochemical staining with anti-MMP-2, anti-MMP-9, anti-TIMP-1 and anti-TIMP-2 antibodies, during the process of veins arterialization.All laboratory methods and techniques were performed in AHEPA University Hospital of Thessaloniki (AHEPA UHT) laboratories of biochemistry and ultrasound of neurovascular diseases and the laboratory of pathology of Medical School of Aristotle University of Thessaloniki. All patients were hospitalized or attended at Outpatient Clinic of Renal Unit of 1st Propaedeutic Medical Department of Internal Medicine of AHEPA UHT.The present doctoral thesis provided a series of major results. Mean serum levels of MMP-2 and MMP-9 were statistically significant increased in patients compared to controls (MMP-2: 365.5±59ng/ml vs 100±27ng/ml and MMP-9: 1465±445ng/ml vs 117±44, p<0.001) and in each group separately (MMP-2 : 378ng/ml for DN group, 353ng/ml for CGN, 106ng/ml for DM, 94ng/ml for healthy group, while MMP-9 : 1591ng/ml for DN, 1338ng/ml for CGN, 133 for DM, 101ng/ml for healthy group). The mean levels for TIMPs appeared respectively decreased. Tissue inhibitor of MMP-9, TIMP-1 serum levels were 493ng/ml for the patient group and 772ng/ml for controls (375ng/ml for DN, 612ng/ml for CGN, 625ng/ml for DM and 919ng/ml for healthy controls). Tissue inhibitor of MMP-2, TIMP-2 serum levels were 119ng/ml for the patient group and 242ng/ml for controls (95ng/ml for DN, 143ng/ml for CGN, 205ng/ml for DM and 279ng/ml for healthy controls). Pearson correlation and t-test showed a significant correlation between MMPs-2 and -9 and kidney function, carotid IMT, atherosclerotic plaque, and albuminuria. Stepwise and multiple regression analysis revealed the link of MMPs-2 and -9 to atherosclerosis, albuminuria and CKD.For the five SNPs, three for MMP-2 and two for MMP-9, were also found some remarkable results. The Genotypic results from the correlation of MMPs-2 and -9 between all groups were performed by Pearson chi-square method and were statistically compared in those four groups (DN, CGN, DM and healthy controls) by Fisher exact test. Logistic regression was used to adjust for gender and age. There was a statistically increase significance for the genotype MMP9-R279Q in all four groups. In our study, patients with primary CGN that are carriers of the genotype MMP9-279Q/Q seem to be highly predisposed (about 4-20 fold!) for HT in comparison with the RR and RQ ones, whereas, for the first time, was demonstrated that the MMP9-279R/R allele acts protectively with regard to the association with HT. There was also reflected an underlying association of the same polymorphism (MMP9-R279Q) with DN, CGN and HT of IgAN, with borderline statistical significance. The MMP2-C735T polymorphism was shown to be associated with CKD, DN and atherosclerosis, while the MMP2-G1575A showed a tendancy to be associated with the patient group of CKD, with a small statistical signigficance.The expression of MMP-2 and MMP-9, measured using immunohistochemical examination, differed statistically very significantly in all types of vascular cells for all four groups in accordance with the non-parametric Friedman test. For the comparison between groups the statistically significant difference remains and increases when grouping of variables for categorical variables by Mann-Whitney test. There is also a statistical important significance for the comparison of MMPs -2 and -9 in atherosclerosis (p<0,000). Spearman correlation was performed in order to demonstrate the apparent strong expression of MMPs -2 and -9 and reduced expression to eliminate of TIMPs-1 and -2 in the patient group. In the whole of patient group (DN and CGN) MMP-2 was negatively associated with TIMP-2 statistically significantly (r: -0.427, p<0.01), while MMP-9 was very strongly negatively associated with TIMP-1, also statistically significantly (r: -0.771, p<0.01). This strong negative correlation remains in the DN group and for MMP-9 with TIMP-1 (r: -0.738, p<0.01), while in the CGN group strengthened further (MMP-2 with TIMP-2, r: -0.587, p<0.01), while for MMP-9 with TIMP-1 arrives to tend to the unit (r: -0.842, p<0.01). When the correlation is added the factor of atherosclerosis, correlations remain strong and statistically significant for MMP-2/TIMP-2 vs ATHUS (r: -0.496, p<0.01) and for MMP-9/TIMP-1 vs ATHUS (r: -0.697, p<0.01).Following animal model of intimal hyperplasia, which leads to stenosis and occlusion or immaturity of AVF, which showed increased expression of MMPs-2 and -9 at the site of arterial stenosis and venous dilatation and thrombosis, while TIMP-1 (acts protectively in atherosclerosis) exhibits reduced expression or total lack of expression, similar model is proposed to humans, according to this study.The results of the present immunohistochemical study to 66 patients showed the expression of MMPs-2 and -9 in the radial artery using immunohistochemical staining with anti-MMP-2 and anti-MMP-9 antibodies. Thus, it was demonstrated in patients with type 2 DN over 3-fold overexpression of MMP-2 in cytoplasmic intense positivity of ECs, SMCs, and FBCs. Expression was up to 3-fold more intense for MMP-9. MMPs -2 and -9 activity and expression in arterial and in arterialized vein walls may lead to structural changes in the ECM (e.g. elastin and collagen fibres), that could explain the increase in vessel diameter with ultimate result of AVF occlusion and thrombosis or inability of maturation.Of the 33 patients with DN of this study 21 showed a marked apoptosis of endothelial layer and appeared only some scattered ECs. These ECs showed a more pronounced expression of MMPs, especially MMP-9, while TIMPs-1 and -2 were not expressed. The remaining 12 patients with DN had moderate apoptosis with stripping intervals of endothelial layer. Seven of 33 patients with DN, whose fistula was thrombosed within six months and other three, whose fistula never matured, extremely strong expression of MMP-9 in the remaining ECs, in the smooth muscle cells and FBCs accompanied totally lacking expression of TIMP-1 in all three types of vascular cells.Of the 33 patients with CGN of this study 13 showed a marked apoptosis of endothelium, while 5 had partial stripping of endothelial layer.From all the above it is concluded that:Increased MMP-2 and MMP-9 serum levels are linked to the pathogenesis of albuminuria and their increase is also associated with the progression of proteinuric disease.MMPs evaluated in this study are risk factors of atherosclerosis as they increase with IMT increasing, atherosclerotic plaque expansion, and also through atherosclerotic ultrasound score (ATHUS).MMP-2 and MMP-9 act enhancing the production of biomarkers VEGF-A and TFG-β1 and therefore they contribute to the onset and evolution of sclerosis and fibrosis following chronic glomerulopathies.MMP-2 and MMP-9 are linked to the pathogenesis of DN, in mesangial proliferation through ECM degradation, vessels BM and GBM degradation, endothelial activation and apoptosis, resulting to podocytopenia and glomerular damage and ultimately chronic glomerular disease.

Τα καρδιαγγειακά επεισόδια αποτελούν σήμερα κύρια αιτία θνητότητας και θνησιμότητας σε ασθενείς με ΧΝΝ. Αξιοσημείωτο είναι το γεγονός ότι η συντριπτική πλειοψηφία των ασθενών αυτών δεν προλαβαίνει να οδηγηθεί σε τελικό στάδιο και ένταξη σε πρόγραμμα υποστήριξης της νεφρικής λειτουργίας. Η παρουσία εμμένουσας λευκωματουρίας χαρακτηρίζει τη ΧΝΝ και τη νεφρική δυσλειτουργία, ενώ τελευταία δεδομένα την αναφέρουν και ως αίτιο νεφρικής βλάβης μεταξύ των ασθενών με ΧΝΝ. Τελευταία, συγκαταλέγεται και μεταξύ των νεότερων παραγόντων καρδιαγγειακού κινδύνου. Παρότι οι παραπάνω παρατηρήσεις υποδεικνύουν κάποια σχέση μεταξύ λευκωματουρίας, ΧΝΝ και ΚΑΝ, δεν έχουν διαλευκανθεί οι υποκείμενοι μηχανισμοί, με τους οποίους η λευκωματουρία συνδέει νεφρική και αγγειακή βλάβη σε ασθενείς με ΧΝΝ. Η οικογένεια των MMPs αποτελεί το κύριο σύστημα, που αποδομεί στον άνθρωπο, τόσο τις φυσιολογικές, όσο και τις παθολογικές πρωτεΐνες της ECM στο νεφρό και στα αγγεία. Τελευταία δεδομένα αναφέρονται στις ΜΜΡs -2 και -9 να εμπλέκονται στη ΧΝΝ και στην ΚΑΝ, πρωτίστως μέσω της αποδόμησης του col-IV, βασικού συστατικού της ECM και της ΒΜ των αγγείων και της GBM στο νεφρό, που άπτεται άμεσα του ενδοθηλίου. Η δράση των MMPs αυτών στην έναρξη και εξέλιξη της ΧΝΝ και της ΚΑΝ επιτυγχάνεται στις περιοχές του σπειράματος και του σωληναρίου στο νεφρό, αλλά και ευρύτερα των αγγείων, μέσω της αναδιάρθρωσης και δομικών αλλαγών των ιστών.Έως το σχεδιασμό του πρωτοκόλλου της παρούσας διδακτορικής διατριβής υπήρχαν ελάχιστα δεδομένα με αντιφατικά αποτελέσματα από κλινικές μελέτες που συσχέτιζαν τις δύο ΜΜΡs, ΜΜΡs -2 και -9, με αθηροσκλήρωση και ιδίως στη ΧΝΝ, ενώ αυτές αφορούσαν ασθενείς σε προχωρημένα και τελικό στάδια υπό αιμοκάθαρση. Δεν υπήρχαν μελέτες που να αξιολογούν τη συσχέτιση των πιο πάνω MMPs με τη λευκωματουρία. Η μόνη μελέτη συσχέτισης της ΜΜΡ-2 με τη λευκωματουρία, σύγχρονης μάλιστα εμφάνισης με την έναρξη της παρούσας μελέτης, περιελάμβανε ασθενείς σε προχωρημένα στάδια ΧΝΝ, με διάφορες αιτίες της νόσου, ενώ πολλοί από αυτούς δεν εμφάνιζαν λευκωματουρία.Κάτω απ΄ αυτό το πρίσμα, κύριος σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνηθεί η εμπλοκή των MMPs -2 και -9 στους παθοφυσιολογικούς μηχανισμούς που συνδέουν τη λευκωματουρία με την αθηροσκλήρωση (καρωτίδων και μηριαίων αρτηριών) στη ΧΝΝ. Έτσι, η αθηροσκλήρωση ελέγχθηκε με τον πρώιμο δείκτη ΙΜΤ, την ύπαρξη αθηρωματικής πλάκας, καθώς και το αθηρωματικό αποτέλεσμα ATHUS για τα τέσσερα αγγεία των δύο καρωτίδων και των δύο μηριαίων αρτηριών (0-8 με ΙΜΤ≥0.8mm=1, IMT<0.8mm=0, παρουσία αθηρωματικής πλάκας με στένωση >25%=1, απουσία αθηρωματικής πλάκας=0), με έναν υψηλής ευκρίνειας υπερηχοτομογράφο. Δευτερεύοντες στόχοι της διατριβής ήταν να συσχετισθούν οι δύο ζελατινάσες, MMPs-2 και -9 με ΑΥ, ΒΜΙ, υπερουριχαιμία, δείκτες υποθρεψίας, φλεγμονής και οξειδωτικού στρες, καθώς και με τους αυξητικούς παράγοντες TGF-β1 και VEGF-A, με σκοπό την ανάδειξη και άλλων μηχανισμών αιτιοπαθογένειας και εξέλιξης ΧΝΝ, που μπορούν να επηρεάζουν και την ποιότητα ζωής των ασθενών αυτών.Στην παρούσα μελέτη έλαβαν μέρος 160 ασθενείς σε πρώιμα και προχωρημένα στάδια (Ι έως IV) ΧΝΝ, καθώς και 66 ασθενείς σε προτελικό και τελικό στάδια ΧΝΝ, χωρίς να έχει ενταχθεί κάποιος σε πρόγραμμα αιμοκάθαρσης (GFR: 12-25 ml/min). Οι ασθενείς ήταν χωρισμένοι σε δύο υποομάδες ανάλογα με το αίτιο της ΧΝΝ, δηλ. 80 με διαβητική νεφροπάθεια (ΔΝ) από σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2 (ΣΔ) (20 σε κάθε στάδιο) και 80 με πρωτοπαθή χρόνια σπειραματονεφρίτιδα (ΣΜΝ), συμπεριλαμβανομένων της ΣΜΝ με ελάχιστες αλλοιώσεις (ΣΜΝΜΕΑ), της μεσαγγειοϋπερπλαστικής ΣΜΝ (ΜΥΣΜΝ), της IgAN, της μεμβρανώδους ΣΜΝ (ΜΣΜΝ) και της εστιακής τμηματικής ΣΜΝ (ΕΤΣΜΝ), επίσης 20 σε κάθε στάδιο ΧΝΝ. Το ίδιο ακριβώς συνέβη και με τους 66 ασθενείς προτελικού-τελικού σταδίου, δηλ. 33 εμφάνιζαν ΔΝ από ΣΔ2 και 33 προερχόταν από α΄ παθή ΣΜΝ. Έτσι, ελέγξαμε το πρόβλημα της λευκωματουρίας από δύο διαφορετικές οδούς (ΣΔ2-ΣΜΝ) και από τα αρχικά στάδια ΧΝΝ, με εξέλιξη προς την προχωρημένη νόσο. Ως υγιείς μάρτυρες επιλέγησαν 112 συμμετέχοντες. Δηλαδή, 56 υγιείς εθελοντές, οι οποίοι δεν ελάμβαναν καμία φαρμακευτική αγωγή και 56 ασθενείς με ΣΔ τ.2 με ιστορικό ΣΔ πάνω από 15 χρόνια χωρίς ΧΝΝ. Για τους πολυμορφισμούς ως μάρτυρες συμπεριλήφθηκαν 106 εθελοντές, από τον ίδιο κορμό υγιών, 45 με ΣΔ τ.2 χωρίς ΧΝΝ και 61 υγιείς μάρτυρες που δεν ελάμβαναν καμία φαρμακευτική αγωγή. Για την ανοσοϊστοχημεία ως υγιείς μάρτυρες συμπεριλήφθηκαν 44 εθελοντές, νοσηλευόμενοι για διερεύνηση κροταφικής αρτηρίτιδας (βιοψία κροταφικής αρτηρίας) και βρέθηκαν αρνητικοί για τη νόσο. Στις πιο πάνω ομάδες ασθενών και υγιών μαρτύρων διενεργήθηκαν τρεις διαφορετικές εργαστηριακές μέθοδοι, προκειμένου να αποσαφηνισθεί ο ρόλος των δύο ΜΜΡs (-2 και -9) στην αθηροσκλήρωση και λευκωματουρία.Στην πρώτη περίπτωση προσδιορίσθηκαν τα επίπεδα ορού των MMΡs -2 και -9 με τους αναστολείς τους ΤΙΜΡs -1 και -2, με ενζυμοανασολογική μέθοδο (ELISA), για τους 160 ασθενείς. Για τους ίδιους ασθενείς στη συνέχεια διενεργήθηκε γονοτυπική ανάλυση πέντε πολυμορφισμών μονών νουκλεοτιδίων (Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs), τρεις για την ΜΜΡ-2 (C735T, C1306T, G1575A) και δύο για την ΜΜΡ-9 (R279Q και C1562Τ) με την μέθοδο της ανταγωνιστικής ειδικής-αλληλόμορφης αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction, PCR). Τέλος, για τους 66 ασθενείς προτελικού-τελικού σταδίου, κατά την προετοιμασία ένταξης σε πρόγραμμα υποκατάστασης της νεφρικής λειτουργίας για την διενέργεια αρτηριοφλεβικής αναστόμωσης (arteriovenous fistula, AVF) ελήφθη τμήμα αγγείου κερκιδικής αρτηρίας, στο οποίο με ιστολογική-ανοσοϊστοχημική μελέτη φάνηκε η έκφραση των δύο ΜΜΡs (ΜΜΡ-2, ΜΜΡ-9) και των αναστολέων τους (ΤΙΜΡ-1, ΤΙΜΡ-2) σε όλες τις κυτταρικές σειρές των στοιβάδων των αγγείων, δηλ. στο ενδοθήλιο, στα λεία μυϊκά κύτταρα και στους ινοβλάστες. Όλες οι μετρήσεις και εξετάσεις υλοποιήθηκαν στα Εργαστήρια Βιοχημικό και Υπερήχων Νευροαγγειακών παθήσεων του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Θεσσαλονίκης ΑΧΕΠΑ (ΠΓΝΘ ΑΧΕΠΑ), καθώς και στο Παθολογοανατομικό Εργαστήριο της Ιατρικής Σχολής του ΑΠΘ ενώ οι ασθενείς προέρχονταν από το Διαβητολογικό και Νεφρολογικό Τμήμα της Α΄ Προπαιδευτικής Παθολογικής Κλινικής (Α΄ΠΡΠ) του ΠΓΝΘ ΑΧΕΠΑ.Η παρούσα διατριβή εμφάνιζε μια σειρά σημαντικών αποτελεσμάτων. Η μέση τιμή των ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 παρουσιάζει στατιστικά σημαντική διαφορά, τόσο μεταξύ ασθενών-μαρτύρων (ΜΜΡ-2: 365.5±59ng/ml έναντι 100±27 και ΜΜΡ-9: 1465±445ng/ml έναντι 117±44, p<0.001), όσο και σε κάθε ομάδα χωριστά (ΜΜΡ-2: 378ng/ml στην ΔΝ ομάδα, 353 στη ΣΜΝ, 106 στη ΣΔ και 94 στους υγιείς, ενώ η ΜΜΡ-9: 1591ng/ml στη ΔΝ, 1338 στη ΣΜΝ, 133 στη ΣΔ και 101 στους υγιείς). Αντίστοιχα ελαττωμένα εμφανίζονταν τα επίπεδα ορού των ιστικών αναστολέων των ΜΜΡs, ΤΙΜΡs. Ο ΤΙΜΡ-1, αναστολέας της ΜΜΡ-9, εμφάνιζε 493ng/ml στην ενιαία ομάδα ασθενών και 772ng/ml στην ομάδα μαρτύρων (375ng/ml στην ομάδα ΔΝ, 612 στη ΣΜΝ, 625 στη ΣΔ και 919 στους υγιείς). Ο ΤΙΜΡ-2, αναστολέας της ΜΜΡ-2, εμφάνιζε 119ng/ml στην ομάδα ασθενών και 242 στην ομάδα μαρτύρων (95ng/ml στην ομάδα ΔΝ, 143 στη ΣΜΝ, 205 στη ΣΔ και 279 στους υγιείς). Η ανάλυση παλινδρόμησης, η συσχέτιση του Pearson και το t-test έδειξαν σημαντική συσχέτιση της ΜΜΡ-2 και της ΜΜΡ-9 με τη νεφρική λειτουργία, τους δείκτες ΙΜΤ καρωτίδων και αθηρωματικής πλάκας, καθώς και με τη λευκωματουρία.Αναφορικά με τους πέντε πολυμορφισμούς, τρεις για την ΜΜΡ-2 και δύο για την ΜΜΡ-9, βρέθηκαν επίσης κάποια αξιοσημείωτα αποτελέσματα. Η συσχέτιση των γονοτύπων των ΜΜΡs -2 και -9 μεταξύ των ομάδων έγινε με τη μέθοδο του Pearson chi-square, η προσαρμογή στο φύλο και την ηλικία με τη λογιστική παλινδρόμηση, ενώ η συσχέτιση των πέντε SNPs με ΑΥ και ATHUS στις δύο ομάδες ασθενών-υγιών διενεργήθηκε με τον ακριβή έλεγχο του Fisher (Fisher exact test). Υπήρχε μεγάλη στατιστική σημαντικότητα για τον ΜΜΡ9-R279Q σε όλες τις ομάδες. Οι ομόζυγοι QQ φαίνονται να διατρέχουν από 4 μέχρι και 20 φορές περισσότερο κίνδυνο για ΑΥ σε σχέση με τους RR και RQ. Διαφαίνεται επίσης κάποια υποκείμενη συσχέτισή του με ΔΝ και ΣΜΝ, καθώς και στην ΑΥ της IgAN, τείνοντας να εμφανίσει στατιστική σημαντικότητα. Ο πολυμορφισμός ΜΜΡ2C735T φαίνεται γενικά να σχετίζεται με τη ΧΝΝ, με τη ΔΝ, καθώς και με αθηροσκλήρωση, ενώ ο ΜΜΡ2-G1575A έδειξε τάση συσχέτισης, στατιστικά οριακά σημαντική, στην ομάδα ασθενών.Από την ανοσοϊστοχημεία, η έκφραση των ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9, διέφερε στατιστικά πολύ σημαντικά και στους τρεις τύπους κυττάρων στις στιβάδες των αγγείων για όλες τις ομάδες, σύμφωνα με τον μη-παραμετρικό έλεγχο του Friedman.Για τη σύγκριση μεταξύ των ομάδων η στατιστικά σημαντική διαφορά παραμένει και αυξάνει κατά την ομαδοποίηση των μεταβλητών με το τεστ του Mann Whitney, για κατηγορικές μεταβλητές. Η στατιστικά μεγάλη σημαντικότητα υπάρχει και στη σύγκριση των ΜΜΡs -2 και -9 με αθηροσκλήρωση (p<0,000). Προκειμένου να καταδειχτεί η διαφαινόμενη έντονη έκφραση των ΜΜΡs -2 και -9 και η ελαττωμένη έκφραση έως εξαλείψεως των ΤΙΜΡs -1 και -2 στην ομάδα ασθενών διενεργήθηκε η συσχέτιση του Spearman. Στην ενιαία ομάδα ασθενών η ΜΜΡ-2 σχετιζόταν με τον ΤΙΜΡ-2 αρνητικά στατιστικά σημαντικά (r: -0.427, p<0.01) και η ΜΜΡ-9 με τον ΤΙΜΡ-1 εμφάνιζε πολύ ισχυρή αρνητική συσχέτιση στατιστικά επίσης σημαντική (r: -0.771, p<0.01). H ισχυρή αρνητική συσχέτιση παραμένει στην ομάδα ΔΝ για την ΜΜΡ-9 με τον ΤΙΜΡ-1 (r: -0.738, p<0.01), ενώ στην ομάδα ΣΜΝ ισχυροποιείται περαιτέρω (ΜΜΡ-2 με ΤΙΜΡ-2, r: -0.587, p<0.01) και για την ΜΜΡ-9 με τον ΤΙΜΡ-1 φθάνει να τείνει στη μονάδα, r: -0.842, p<0.01.Όταν στη συσχέτιση αυτή προστίθεται και ο παράγοντας της αθηροσκλήρωσης, οι συσχετίσεις παραμένουν σημαντικές για ΜΜΡ-2/ΤΙΜΡ-2 vs ATHUS (r: -0.496, p<0.01) και για ΜΜΡ-9/ΤΙΜΡ-1 vs ATHUS (r: -0.697, p<0.01). Ακολουθώντας το ζωικό μοντέλο υπερπλασίας του έσω χιτώνα, της στένωσης και απόφραξης της AVF, όπου φάνηκε αυξημένη έκφραση των ΜΜΡs -2 και -9 στο σημείο της στένωσης, ενώ ο ΤΙΜΡ-1 έχει μειωμένη έκφραση (δρα προστατευτικά στην αθηροσκλήρωση), ανάλογο μοντέλο προτάσσεται και στον άνθρωπο, σύμφωνα και με την παρούσα μελέτη. Τα αποτελέσματα της παρούσας ανοσοϊστοχημικής μελέτης σε 66 ασθενείς εμφανίζουν την έκφραση των ΜΜΡs -2 και –9 στην κερκιδική αρτηρία χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημική χρώση με αντι-ΜΜΡ-2 και αντι-ΜΜΡ-9 αντισώματα. Έτσι αποδείχθηκε σε ασθενείς με τύπου 2 ΔΝ η πάνω από 3 φορές υπερέκφραση της ΜΜΡ-2 με κυτταροπλασματική θετικότητα των ενδοθηλιακών κυττάρων, των λείων μυικών κυττάρων και των ινοβλαστών. Η έκφραση ήταν έως τρεις φορές πιο έντονη από την ΜΜΡ-2 όσον αφορά την ΜΜΡ-9. Η ενεργότητα και η έκφραση των ΜΜΡs -2 και –9 στα αρτηριακά τοιχώματα και στα τοιχώματα των αρτηριοποιημένων φλεβών μπορεί να οδηγήσει σε δομικές αλλαγές της σύνθεσης της ECM (κολλαγόνες ίνες), η οποία θα μπορούσε να εξηγήσει την αύξηση της διαμέτρου των αρτηριοποιημένων φλεβών, με απώτερο αποτέλεσμα την θρόμβωση της AVF ή την αδυναμία ωρίμανσής της.Στους 33 ασθενείς της παρούσας μελέτης με ΔΝ, 21 εμφάνιζαν έντονη απόπτωση της ενδοθηλιακής στιβάδας και διάσπαρτα ενδοθηλιακά κύτταρα. Τα ενδοθηλιακά αυτά κύτταρα εμφάνιζαν πιο έντονη έκφραση των MMPs και ιδίως της ΜΜΡ-9, ενώ δεν φάνηκε έκφραση του ΤΙΜΡ-1. Οι υπόλοιποι 12 ασθενείς με ΔΝ εμφάνιζαν μέτρια απόπτωση με διαστήματα απογύμνωσης της ενδοθηλιακής στοιβάδας. Σε 7 από τους 33 ασθενείς με ΔΝ, των οποίων η φίστουλα θρομβώθηκε εντός εξαμήνου, καθώς και σε άλλους 3, των οποίων η φίστουλα δεν ωρίμασε ποτέ, η εξαιρετικά έντονη έκφραση της ΜΜΡ-9 στα εναπομείναντα ενδοθηλιακά κύτταρα, στα λεία μυϊκά κύτταρα και στους ινοβλάστες συνοδευόταν από παντελή έλλειψη έκφρασης του ΤΙΜΡ-1 και στους τρεις τύπους αγγειακών κυττάρων.Από τους 33 ασθενείς με ΣΜΝ, 13 εμφάνιζαν έντονη απόπτωση της ενδοθηλιακής στιβάδας, ενώ 5 εμφάνιζαν τμηματική απογύμνωσή της.Από όλα τα παραπάνω συμπεραίνεται ότι:Τα αυξημένα επίπεδα των ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 στον ορό συνδέονται με την αιτιοπαθογένεια της λευκωματουρίας και η αύξησή τους έχει επίσης σχέση με την εξέλιξη της πρωτεϊνουρικής νόσου.Οι ΜΜPs που αξιολογήθηκαν στην παρούσα μελέτη αποτελούν παράγοντες κινδύνου για την αθηροσκλήρωση, δηλαδή για την αύξηση του ΙΜΤ και της αθηρωματικής πλάκας των καρωτίδων και των μηριαίων αρτηριών, καθώς και για την διαβάθμιση του αθηρωματικού υπερηχογραφικού δείκτη (ATHUS).Οι ΜΜΡs -2 και ΜΜΡ-9 δρουν ευωδοτικά στην παραγωγή των βιομορίων VEGF και TGF-β και ως εκ τούτου συμβάλλουν στην εμφάνιση σκλήρυνσης και ίνωσης που ακολουθεί τις χρόνιες σπειραματοπάθειες.Οι ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 συνδέονται με την παθογένεια της διαβητικής νεφροπάθειας, δηλαδή την μεσαγγειακή υπερπλασία, μέσω της αποδόμησης της ECM, της εκφύλισης της ΒΜ των αγγείων και της GBM στο νεφρό, της ενεργοποίησης και απόπτωσης του ενδοθηλίου, την ποδοκυττοπενία και την χρόνια βλάβη του σπειράματος.