Μελέτη των αναστολέων των μεταλλοπρωτεϊνασών στην αθηρωμάτωση

Abstract

Introduction: Atherosclerosis is a disease of the arterial wall with high levels ofmorbidity and mortality. Modern therapeutic interventions aim towards both theattenuation of the lumen stenosis as well as the stabilization of the atheromatousplaque and the avoidance of its rupture, which is the cause of the majority ofcardiovascular events. The unstable plaque can be identified by its thin fibrous cap, alesser amount of extracellular connective proteins (collagen and elastin) and extensiveinflammation. The cleavage of collagen and elastin weakens the atheromatous plaque,and is mediated by specific proteolytic molecules, the matrix metalloproteinases(MMPs), which are mostly produced by inflammatory cells (macrophages, foam cells)and the Smooth Muscle Cells within the atheroma. Accumulating evidence pointtowards the fact that the MMPs and their tissue inhibitors (TIMPs) are involved in adelicate balance, which in great part defines the clinical outcome of the disease.Statins, that are proven to exert atheroprotective role through their effect ondecreasing cholesterol blood levels, are thought to have additional atheroprotectivemechanisms through the modification of signaling pathways that control theinflammatory process and influence the MMP and TIMP expression and function.Systematic, long term exercise is known to positively contribute in the attenuation ofcardiovascular disease. The modification of the traditional cardiovascular risk factorsthrough exercise, can only in part explain its’ atherosclerosis ameliorating results,leading scientists to search for additional atheroprotective actions of exercise. Amongothers, the modification of MMP and TIMP expression and function are considered.Aim: Subject of the present study was to investigate the effects of two antiatherosclerotictherapeutic strategies, that of atorvastatin treatment and of systematicexercise, as well as their combined effects on the MMP and TIMP function, inconjunction with the atheromatous plaques’ size and stability.Experimental design: Prospective, randomized, controlled, interventional study.Setting: Center of Experimental Surgery, Foundation of Biomedical Research,Academy of Athens.Subjects: Male ApoE-/- C57BL/6J knockout mice.Methods: At the age of 8 weeks, mice were randomized in the following groups: a)Control group (CO, n=10), b) Atorvastatin treatment group (AT, n=10), c) Exercisetreatment group (EX, n=10), d) Combined atorvastatin and exercise treatment group (AT+EX, n=10). All groups were fed atherogenic, “western type” high-fat diet for thewhole study duration (24 weeks). At the beginning of the 16th week the all groupsbesides CO began receiving the predefined therapeutic intervention. Atorvastatin(10mg/kg) was administered in group AT daily for the rest of the study duration(8weeks). Group EX underwent an exercise program on a motorized treadmill(8weeks, 5days/week, 40min/session, 12m/min, 5o inclination). Group AT+EXreceived atorvastatin treatment similar to group AT, and concurrently underwent thesame exercise program as group EX. At the end of the study all mice were sacrificed.The aortic arch was removed and was further processed for paraffin embedding andoptical microscopy sectioning, while the thoracic aorta was deep frozen for lateranalysis. The area of the lumen cross-section and that of the atheromatous plaqueswas measured histochemically, and the lumen stenosis factor was calculated.Additionally, the positive stain ratio of the plaques for collagen, elastin, macrophages,smooth muscle cells, ΜΜΡ-2, ΜΜΡ-3, ΜΜΡ-8, ΜΜΡ-9, ΤΙΜΡ-1, ΤΙΜΡ-2 andTIMP-3 was measured, by means of histochemical and immunohistochemical methods. Blood samples were acquired from all mice at the beginning of the study,after the atherosclerosis establishment (16th week) and at the study’s end. Blood levelsof total cholesterol, glucose, and triglycerides were determined as well as theconcentrations of ΜΜΡ-2, ΜΜΡ-3, ΜΜΡ-8, MMP-9, ΤΙΜΡ-1, TIMP-2 and TIMP-3.The thoracic aorta sections were zymographically analyzed for the determination ofMMP-2, MMP-9, TIMP-1 and TIMP-2 activity.Results: Both therapeutic interventions attenuated atherosclerosis development. Thiswas evident in the lower extent of the atheromatic lesions in the ΑΤ group, and in thelower degree of lumen stenosis in all intervention groups. Furthermore, thetherapeutic modalities acted in synergy, achieving significantly better results in thecombined intervention group. All interventions failed to differentiate the experimentalgroups regarding weight loss and blood glucose, while only the atorvastatinadministration modestly reduced blood lipids. Atheromatous plaques showed a morestable phenotype in the intervention groups, containing more collagen and elastin,with elastin being further increased in the AT+EX group. These changes wereaccompanied by a favorable modification of MMP-3, MMP-8 and MMP-9. MMP-8function was closely associated with collagen levels, while the reduction in MMP-9prevalence and function was loosely related to the elevated levels of elastin.Therepautic interventions did not affect the smooth muscle cell content of the lesions, but did reduce the presence of macrophages in the athromatous plaques, but thecombined intervention did not confer additional changes. Exercise treatment increasedTIMP-1 levels, and subsequently reduced the net proteolytic activity within theplaque. On the contrary, TIMP-2 was decreased in all intervention groups and TIMP-3 appeared unaffected. While the blood levels of the above molecules increasedduring atherosclerosis development in comparison with baseline measurements (withthe exception of TIMP-3), they did not change after the therapeutic interventions inaccordance to their intra-plaque levels. Active MMP-2 was reduced after atorvastatinadministration, increased after exercise treatment and exhibited unchanged levels afterthe combined interventions. Its proenzyme expression though, was reduced after allinterventions.Conclusions: The two therapeutic strategies act with synergy regarding the extent ofthe atheromatic lesions and lumen stenosis. Moreover, they stabilize the plaque byincreasing its content in elastin and collagen, which is achieved mainly by theirinfluence on MMP and TIMP levels. The increased elastin levels are attributed ingreat part in the modification of MMP-2/TIMP-2 balance and in the MMP-9 levels reduction that is achieved through the lower extent of macrophage prevalence insidethe plaque. MMP-8 concentration in the lesion area is correlated with the pattern ofcollagen preservation. The effects of both atorvastatin and exercise on the MMP andTIMP levels are mainly associated with the macrophage amount and type, and not inchanges regarding smooth muscle cells. The increased MMP-2, MMP-3, MMP-8 andMMP-9, as well as TIMP-1 and TIMP-2 (but not TIMP-3) blood concentration is amarker of atherosclerosis. On the other hand, blood levels of MMP-2, MMP-3 andMMP-8 are not correlated with their concentration within the atheromatous plaqueafter the therapeutic interventions, and therefore cannot serve as markers of thedisease development or amelioration.

Εισαγωγή: Η αθηρωμάτωση αποτελεί μια πάθηση του αρτηριακού τοιχώματος με εξαιρετικά μεγάλη νοσηρότητα και θνητότητα. Στόχος των παρεμβάσεων αντιμετώπισής της αποτελεί πλέον εκτός του μετριασμού του στενωτικού της χαρακτήρα, η σταθεροποίηση των αθηρωματικών πλακών, που με τη ρήξη τους μπορούν να προκαλέσουν πληθώρα καρδιαγγειακών συμβαμάτων. Η ασταθήςαθηρωματική πλάκα χαρακτηρίζεται μεταξύ άλλων από λεπτή ινώδη κάψα,μειωμένες συγκεντρώσεις των εξωκυττάριων συνδετικών πρωτεϊνών (κολλαγόνου και ελαστίνης), κι εκτεταμένη φλεγμονώδη αντίδραση. Η λύση του κολλαγόνου και της ελαστίνης αποδυναμώνει την αθηρωματική πλάκα, και καταλύεται από συγκεκριμένα πρωτεολυτικά ένζυμα, τις μεταλλοπρωτεϊνάσες (MMPs), οι οποίες παράγονται κυρίως από τα φλεγμονώδη κύτταρα (μακροφάγα, αφρώδη κύτταρα) και τα λεία μυϊκά κύτταρα της αθηρωματικής περιοχής. Υπάρχουν ισχυρές ενδείξεις ότι οι MMPsκαι οι αναστολείς τους (TIMPs) βρίσκονται σε μια λεπτή ισορροπία που καθορίζει σε μεγάλο βαθμό την κλινική έκβαση της νόσου. Οι στατίνες, που αποδεδειγμένα ασκούν αθηροπροστατευτικό ρόλο μέσω της μείωσης της χοληστερόλης στο αίμα, πιστεύεται τελευταία ότι ασκούν επιπλέον προστασία μέσω της ρύθμισης μονοπατιών σήμανσης που ελέγχουν τη φλεγμονώδη αντίδραση και επηρεάζουν την έκφραση και λειτουργία των MMPs και των αναστολέων τους. Η συστηματική, μακροχρόνια άσκηση είναι γνωστό ότι συμβάλλει στη μείωση της καρδιαγγειακής νοσηρότητας και θνητότητας.Η τροποποίηση των κλασσικών παραγόντων καρδιαγγειακού κινδύνου μπορεί μόνο εν μέρει να εξηγήσει τα ευεργετικά αποτελέσματα της άσκησης οδηγώντας τους ερευνητές να αναζητήσουν επιπλέον αντιαθηρογόνες δράσεις της, μεταξύ άλλων και της τροποποίησης της έκφρασης και λειτουργίας των MMPs και των TIMPs.Σκοπός: Αντικείμενο της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η διερεύνηση της επίδρασης δύο θεραπευτικών στρατηγικών έναντι της αθηρωμάτωσης, της χορήγησης ατορβαστατίνης και της συστηματικής άσκησης, αλλά και του συνδυασμού τους, στη λειτουργία των MMPs και των αναστολέων τους και η συσχέτιση των επιδράσεων αυτών με την εξέλιξη της αθηρωματικής νόσου, όπως αυτή προσδιορίζεται από το μέγεθος και την σταθερότητα των αθηρωματικών αλλοιώσεων.Πειραματικός σχεδιασμός: Προοπτική, τυχαιοποιημένη, ελεγχόμενη μελέτη παρέμβασης. Τοποθεσία: Κέντρο Πειραματικής Χειρουργικής, Ίδρυμα Ιατροβιολογικών Ερευνών Ακαδημίας Αθηνών. Πειραματόζωα: Αρσενικοί μύες με ομόζυγη έλλειψη της απολιποπρωτεϊνης Ε(ApoE-/- C57BL/6J knockout mice).Μέθοδος: Την 8η εβδομάδα ηλικίας τους οι μύες τυχαιοποιήθηκαν στις παρακάτω ομάδες: α) Ομάδα ελέγχου αθηρωμάτωσης (CO, n=10), β) Ομάδα χορήγησης ατορβαστατίνης. (ΑΤ, n=10) γ) Ομάδα άσκησης (EX, n=10). δ) Ομάδα συνδυασμένης παρέμβασης ατορβαστατίνης και άσκησης (AT+EX, n=10). Σε όλες τις ομάδες χορηγήθηκε ειδική αθηρογόνος τροφή, με υψηλή περιεκτικότητα σε λιπαρά, για 24 εβδομάδες. Την 16η πειραματική εβδομάδα, ξεκίνησαν οι θεραπευτικές παρεμβάσεις στις ομάδες πλην τηs CO. Στους μύες της ομάδας AT χορηγήθηκε ατορβαστατίνη10mg/Kgr βάρους/ημέρα μέχρι το τέλος της μελέτης. Οι μύες της ομάδας EXυποβλήθηκαν σε πρόγραμμα εκγύμνασης σε ειδικό κυλιόμενο τάπητα μέχρι το πέρας της μελέτης, και οι μύες της ομάδας AT+EX έλαβαν ατορβαστατίνη ομοίως με τους μύες της ομάδας AT και ταυτόχρονα ακολούθησαν πρόγραμμα άσκησης ομοίως με τους μύες της ομάδας EX. Με το τέλος της μελέτης ακολούθησε ευθανασία των μυών. Έγινε λήψη του αορτικού τόξου των μυών προς έγκλειση σε παραφίνη και τομές μικροσκοπίας, και συντήρηση σε βαθιά κατάψυξη της θωρακικής αορτής. Με ιστολογική ανάλυση προσδιορίστηκε το εμβαδό του αγγειακού αυλού και των αθηρωματικών πλακών, και ο βαθμός στένωσης του αυλού κατά μήκος τους αορτικού τόξου. Επιπλέον, με ιστοχημικές και ανοσοϊστοχημικές μεθόδους προσδιορίστηκε το ποσοστό της επιφάνειας της αθηρωματικής πλάκας με θετική χρώση για κολλαγόνο,ελαστίνη, μακροφάγα, λεία μυϊκά κύτταρα, ΜΜΡ-2, ΜΜΡ-3, ΜΜΡ-8, ΜΜΡ-9,ΤΙΜΡ-1, ΤΙΜΡ-2 και TIMP-3. Αιμοληψίες έγιναν σε όλους τους μύες κατά την έναρξη της μελέτης, μετά την ανάπτυξη αθηρωμάτωσης (16η εβδομάδα) και κατά τη λήξη της μελέτης και προσδιορίστηκαν τα επίπεδα της γλυκόζης, της ολικής χοληστερόλης, των τριγλυκεριδίων, της ΜΜΡ-2, της ΜΜΡ-3, της ΜΜΡ-8, της MMP-9, του ΤΙΜΡ-1, του TIMP-2 και του TIMP-3 στο αίμα. Τα τμήματα της θωρακικής αορτής αναλύθηκαν με ζυμογραφία για προσδιορισμό της ενεργού/ανασταλτικής δράσης της MMP-2, της MMP-9, του TIMP-1 και του TIMP-2.Αποτελέσματα: Και οι δύο θεραπευτικές παρεμβάσεις επιβράδυναν την εξέλιξη της αθηρωματικής πλάκας. Αυτό εκφράστηκε ως μειωμένη έκταση του αθηρώματος στις ομάδες που έλαβαν ατορβαστατίνη, και ως μειωμένος βαθμός στένωσης σε όλες τις ομάδες παρέμβασης. Επιπλέον, οι δύο θεραπευτικές παρεμβάσεις εμφάνισαν συνέργεια επιτυγχάνοντας σημαντικά καλύτερα αποτελέσματα στην ομάδα συνδυασμένης παρέμβασης. Όλες οι παρεμβάσεις απέτυχαν να διαφοροποιήσουν τις ομάδες σε σχέση με την απώλεια βάρους και τη γλυκόζη αίματος, ενώ μόνο η χορήγηση ατορβαστατίνης πέτυχε μέτριου βαθμού μείωση των λιπιδίων του αίματος.Οι αθηρωματικές πλάκες εμφάνισαν σταθερότερο φαινότυπο στις ομάδες παρέμβασης, με περισσότερο κολλαγόνο κιι ελαστίνη, και με την ελαστίνη να είναι περεταίρω αυξημένη στην ομάδα συνδυασμού παρεμβάσεων. Οι αλλαγές αυτές συνοδεύτηκαν από ευνοϊκή ρύθμιση των MMP-3, MMP-8 και MMP-9. Η λειτουργικότητα της MMP-8 φάνηκε να είναι σε στενή συνάρτηση με τα επίπεδα κολλαγόνου, ενώ η μείωση της MMP-9 σχετίζεται εν μέρει με τα αυξημένα επίπεδα ελαστίνης. Οι θεραπευτικές παρεμβάσεις δε μετέβαλλαν σημαντικά τη σύσταση της αθηρωματικής πλάκας σε λεία μυϊκά κύτταρα, μείωσαν όμως το περιεχόμενό της σε μακροφάγα, χωρίς ο συνδυασμός τους να επιφέρει επιπλέον οφέλη. Η παρέμβαση της άσκησης αύξησε τα επίπεδα του TIMP-1, μεταβάλλοντας την καθαρή πρωτεολυτική δραστηριότητα εντός της πλάκας. Αντίθετα, ο TIMP-2 μειώθηκε σε όλες τις ομάδες θεραπευτικής παρέμβασης, ενώ ο TIMP-3 δεν παρουσίασε μεταβολή. Τα επίπεδα των μορίων αυτών στο αίμα, αν και αυξήθηκαν σε συνάρτηση με την ανάπτυξη αθηρωμάτωσης (με εξαίρεση τον TIMP-3), δεν μετέβαλαν τις συγκεντρώσεις τους στο αίμα μετά από τις θεραπευτικές παρεμβάσεις αντίστοιχα με τα επίπεδά τους στην πλάκα. Η ενεργός μορφή της MMP-2 μειώθηκε μετά από χορήγηση ατορβαστατίνης,αυξήθηκε με την άσκηση και παρέμεινε σε σταθερά επίπεδα κατά τον θεραπευτικό συνδυασμό. Τα προένζυμα όμως της MMP-2 μειώθηκαν μετά από όλες τις παρεμβάσεις. Συμπεράσματα: Οι δύο θεραπευτικές παρεμβάσεις παρουσιάζουν συνέργεια όσον αφορά στην έκταση των αθηρωματικών αλλοιώσεων και τη στένωση, με το συνδυασμό των δύο στρατηγικών να δίνει εμφανώς καλύτερα αποτελέσματα. Επίσης σταθεροποιούν το φαινότυπο της πλάκας, αυξάνοντας την περιεκτικότητα σε ελαστίνη και κολλαγόνο, δράσεις προς σταθεροποίηση της αθηρωματικής πλάκας που είναι σε μεγάλο βαθμό συνάρτηση της επίδρασής τους στα επίπεδα MMPs καιTIMPs. Ο μηχανισμός της αύξησης της ελαστίνης σχετίζεται με την ελαττωμένη τηςλύση, μέσω της ισορροπίας MMP-2/TIMP-2 και μέσω της μείωσης των επιπέδωνMMP-9 που προκύπτουν από τη μεταβολή της σύστασης της αθηρωματικής πλάκας σε μακροφάγα κύτταρα. Η συγκέντρωση της MMP-8 στην αθηρωματική πλάκα παρουσιάζει ισχυρή συσχέτιση με το μοτίβο συντήρησης του κολλαγόνου. Οι επιδράσεις της ατορβαστατίνης και της άσκησης στα επίπεδα των MMPs και τωνTIMPs σχετίζονται πρωτίστως με μεταβολές στο πλήθος και τον φαινότυπο των μακροφάγων, και όχι σε μεταβολές στα λεία μυϊκά κύτταρα. Η αύξηση των συγκεντρώσεων της MMP-2, MMP-3, MMP-8 και MMP-9, όπως επίσης και τωνTIMP-1 και TIMP-2 (αλλά όχι του TIMP-3) στο αίμα αποτελούν δείκτες αθηρωμάτωσης. Οι συγκεντρώσεις όμως των δεικτών των MMP-2, MMP-3 καιMMP-8 στο αίμα δεν σχετίζονται άμεσα με τις συγκεντρώσεις τους στην αθηρωματική πλάκα έπειτα από τις θεραπευτικές παρεμβάσεις και άρα δεν μπορούν να αποτελούν δείκτες της εξέλιξης της νόσου.