Μελέτη μηχανισμών αντιγραφής και επιδιόρθωσης του γενετικοί υλικού με τεχνικές λειτουργικής μικροσκοπίας και χρήση αλγορίθμων επεξεργασίας-ανάλυσης εικόνας

Abstract

The spatiotemporal regulation of DNA replication is safeguarded via a process called licensing of DNA replication. In metazoan, a functionally conserved protein -Cdt1- is the key factor that ensures the regulation of licensing and it is tightly regulated through various biological pathways. In case that the regulation of Cdt1 is disturbed, genomic instability, uncontrolled replication and apoptosis may occur.Genomic instability may also occur in an organism after DNA damage, either due to environmental factors, or due to random mutations occurring during metabolism. Evolution has provided cells with various DNA damage response mechanisms for specific kinds of damages. The cell cycle regulatory protein Cdt1 has been postulated to interlink cell cycle and DNA damage responses, therefore Cdt1 is a very interesting protein for further studying.Despite the fact that the exact role of Cdt1 at the sites of damage remains a puzzle, the current regulation model of Cdt1 is based on in vitro experiments in Xenopus egg extracts. This model postulates that upon DNA damage, PCNA is loaded onto chromatin and then Cdt1 associates with PCNA through its N-terminal PCNA interacting motif (PIP-box). Cdt1 then interacts with Cdt2 WD regions. Cdt2 is therefore recruited to the chromatin via direct interactions with Cdt1 and targets Cdt1 for ubiquitilation. At the first part of this study we aim to unravel the protein-protein interaction cascade regulating Cdt1 proteolysis after ultraviolet (UVC) induced DNA damage in human cancer cells by employing functional microscopy techniques. Initially once localised UVC radiation is inflicted upon cells, PCNA is recruited rapidly at the sites of damage and binds onto the chromatin robustly, serving as a scaffold for repairing complexes. In contrast with the current notion, Cdt2 is shown to be recruited at sites of damage independently from its substrates and maintains long-term interactions, regulating proteins that participate in the DNA damage response. It is recruited by direct interactions onto PCNA through a newly found C-terminal PiP box. Moreover, it is shown that binding of Cdt1 to sites of damage is stabilised by interactions with Cdt2. Lastly, ATR-dependent phosphorylation of Cdt2 inhibits stabilisation of Cdt1 onto damage chromatin, thereby fine-tuning Cdt1 regulation. On the second part of this study, we try to shed light on the exact role of Cdt1 at the sites of DNA damage and its implications in the choice of DNA damage repair pathways, in particular between Non-Homologous end Joining (NHEJ) and Homologous Recombination (HR). DNA double strand breaks (DSBs) were induced either with the use of X-ray irradiation or with a UVA pulsed laser (355nm) nanosurgery system in human breast (MCF7) and cervical (HeLa kyoto) cancer cells. The current study showed that the absence of Cdt1 enhances the recruitment kinetics of TLS polymerases (polκ and polη) onto PCNA and damaged sites. In addition, it is presented that the Cdt1 absence impairs the formation of 53BP1 and RIF1 irradiation induced foci (IRIF) at the sites of X-ray-induced DSBs, while it does not seem to significantly affect the formation of BRCA1 IRIF.At the third and last part of the study we present methods for semi-automatic quantitative and qualitative image analysis that were developed with the use of ImageJ and Fiji. These macros were used to quantify the recruitment protein kinetics at the sites of damage, quantify in a high-throughout manner the metrics (number, intensity, volume and position) of IRIFs in unsychronized cells and classify them by cell cycle phase. Also, macros for image preprocessing (background subtraction and segmentation), genomic content calculation and subnuclear distances in 3D space were implemented

Η χωροχρονική ρύθμιση της αντιγραφής του γενετικού υλικού εξασφαλίζεται διαμέσου της αδειοδότησης. Στα ευκαρυωτικά κύτταρα, η πρωτεΐνη Cdt1 καθορίζει πότε θα λάβει χώρα η αδειοδότηση και η έκφρασή της είναι αυστηρώς ρυθμισμένη διαμέσου πολλαπλών μονοπατιών. Διατάραξη αυτής της ισορροπίας στη ρύθμισης της αντιγραφής δύναται να οδηγήσει σε γονιδιωματική αστάθεια, ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό ή σε κυτταρικό θάνατο.Γονιδιωματική αστάθεια σε ένα οργανισμό μπορεί να προκληθεί από βλάβες στο γενετικό υλικό, είτε εξαιτίας περιβαλλοντικών παραγόντων, είτε εξαιτίας τυχαίων αλλαγών που συμβαίνουν κατά τη διάρκεια του μεταβολισμού του. Για την αντιμετώπιση των διαφόρων βλαβών έχουν εξελικτικά προκύψει επιδιορθωτικοί μηχανισμοί εξειδικευμένοι στην αντιμετώπιση κάθε τύπου βλάβης. Η πρωτεΐνη Cdt1 φαίνεται να διασυνδέει τα μονοπάτια της αδειοδότησης της αντιγραφής με αυτά της απόκρισης σε βλάβη στο DNA, γεγονός που τον καθιστά ενδιαφέροντα για περαιτέρω μελέτη.Παρά το γεγονός ότι ο ακριβής ρόλος του Cdt1 στην περιοχή της βλάβης είναι άγνωστος, το παρόν επικρατές μοντέλο ρύθμισης του Cdt1 βάση in vitro πειραμάτων σε πρωτεϊνικά εκχυλίσματα αυγών Xenopus δείχνει ότι το Cdt1 αρχικά προσδένεται στην περιοχή της βλάβης μέσω αλληλεπίδρασης με το PCNA. Ακολούθως, το Cdt2 στρατολογείται στην περιοχή της βλάβης μέσω του Cdt1 και το στοχεύει για πρωτεολυτική ρύθμιση. Στο πρώτο μέρος της μελέτης μελετήθηκαν οι αλληλεπιδράσεις των μερών του συμπλόκου PCNA-Cdt1-Cdt2 οι οποίες συμβαίνουν ύστερα από βλάβη υπεριώδους ακτινοβολίας σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα με τη χρήση λειτουργικής μικροσκοπίας. Κατόπιν εφαρμογής εντοπισμένης υπεριώδους ακτινοβολίας, το PCNA πηγαίνει γρήγορα και δεσμεύεται ισχυρά με τη χρωματίνη στη περιοχή της βλάβης. Σε αντίθεση με το ότι έδειχνε το παρόν επικρατές μοντέλο, αποδεικνύεται ότι το Cdt2 στρατολογείται στην περιοχή της βλάβης ανεξάρτητα από τα υποστρώματά του και διατηρεί μακροχρόνιες αλληλεπιδράσεις με τη χρωματίνη. Η δέσμευση του Cdt2 στην περιοχή της βλάβης γίνεται μέσω άμεσης αλληλεπίδρασης με το PCNA μέσω μοτίβου αλληλεπίδρασης με το PCNA (PiP-box) που ανακαλύφθηκε στην καρβοξυτελική περιοχή του. Το Cdt1 στρατολογείται στην περιοχή της βλάβης μέσω PiP-box στο αμινοτελικό άκρο και σταθεροποιείται στην περιοχή της βλάβης διαμέσου άμεσης αλληλεπίδρασης με το Cdt2. Επίσης, μελετήθηκε η επίδραση της φωσφορυλίωσης του Cdt2 από την ATR κινάση. Φαίνεται ότι το Cdt2 εφόσον φωσφορυλιωθεί αναστέλλει την σταθεροποίηση του Cdt1 στη περιοχή της βλάβης.Στο δεύτερο μέρος της μελέτης ερευνάται ο ρόλος του Cdt1 στην περιοχή της βλάβης και η πιθανή εμπλοκή του στην επιλογή κατάλληλου επιδιορθωτικού μηχανισμού διπλών θραύσεων του DNA. Τα πειράματα που περιγράφονται μελετούν διπλές θραύσεις οι οποίες έγιναν είτε με χρήση ακτίνων X είτε με την χρήση παλμικού UVA laser 355nm σε διαφορετικές ανθρώπινες καρκινικές σειρές. Στην παρούσα μελέτη φαίνεται ότι η απουσία του Cdt1 φαίνεται να αυξάνει τον ρυθμό συγκέντρωσης των TLS πολυμερασών polκ και polη στην περιοχή της βλάβης παίζοντας ρόλο στην χρονική ρύθμιση της επιδιόρθωσης. Επίσης, πειράματα που έγιναν με ημιαυτόματους αλγόριθμους επεξεργασίας και ανάλυσεις εικόνας σε εικόνες συνεστιακού μικροσκοπίου, βρέθηκε ότι η απουσία του Cdt1 επηρεάζει αρνητικά την συγκέντρωση παραγόντων επιδιόρθωσης διπλών θραύσεων μέσω του μη ομόλογου συνδυασμού άκρων (NHEJ) 53BP1 και Rif1 σε ανθρώπινες καρκινικές σειρές μαστού (MCF7) και τραχήλου (HeLa kyoto), ενώ δεν φαίνεται να επηρεάζεται σημαντικά η συσσώρευση παραγόντων που εμπλέκονται στην έναρξη του ομόλογου ανασυνδυασμού όπως το BRCA1.Στο τρίτο μέρος της μελέτης παρουσιάζονται αναλυτικές μέθοδοι ποσοτικοποίησης και ποιοτικής ανάλυσης που αναπτύχθηκαν για την μελέτη τόσο της πρωτεϊνικής κινητικής στρατολόγησης σε ζωντανά κύτταρα (recruitment-timelapse) αλλά και για την ημι-αυτοματοποιημένη μέτρηση εστιών σε υποπυρηνικές περιοχές και τη ποσοτικοποίηση πυρηνικών πρωτεΐνών σε διαφορετικές φάσεις του κυτταρικού κύκλου. Τέλος θα περιγραφούν αλγόριθμοι προεπεξεργασίας εικόνας για μετρήσεις αποστάσεων και όγκων.