Δυναμικές ιδιότητες της ολμεσαρτάνης στο διάλυμα και στο ενεργό κέντρο του υποδοχέα τύπου 1 της αγγειοτασίνης ΙΙ: βελτιστοποίηση φαρμακευτικού προφίλ βιοδραστικών ενώσεων μέσω συμπλόκων εγκλεισμού

Abstract

In this thesis, we utilized an array of biophysical techniques to characterize in atomic level the interactions formed in small molecules and their receptors along with inclusion complexes. A special emphasis was given to complement the specific studies with in silico studies. The conformational properties of olmesartan and its methylated analogue were charted using a combination of NMR spectroscopy and molecular modeling. For the molecular docking calculations three different types of angiotensin II type 1 receptor (AT1R) have been used: (a) the crystal structure; (b) a homology model based on the structure of CXCR4 and (c) a homology model based on the structure of rhodopsin. The aim of this study was to possibly explain the differences between the experimental findings derived from mutagenesis studies on this receptor and the crystal structure of the AT1R-olmesartan complex. Molecular Dynamics (MD) experiments were performed to show the stability of the AT1R-inverse agonist complex and the most prominent interactions during the simulated trajectory. The obtained results showed that olmesartan and its methyl ether exert similar interactions with critical residues justifying their almost identical in vitro activity. However, the docking and MD experiments failed to justify the mutation findings in a satisfactory matter, indicating that the real system is more complex and crystal structure or homology models of AT1R receptors cannot simulate it sufficiently. Various conformations of olmesartan and olmesartan methyl ether were simulated to provide chemical shifts. These were compared with the experimental NMR results. Useful information regarding the putative bioactive conformations of olmesartan and its methylated analogue has been obtained. Finally, comparative data regarding the binding poses and energies of olmesartan, olmesartan methyl ether and three derivative compounds of olmesartan (R239470, R781253, R794847) were acquired using Prime/MM-GBSA calculations.In silico studies, have been also utilized in an effort to determine the architecture of inclusion complexes of natural products and hosts. As host we used both different cyclodextrin derivatives as also calixarens. Specifically, the interaction between the hepatoprotectant drug silibinin and the host 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HP-β-CD) has been elucidated at the molecular level. The complexation product of silibinin with HP-β-CD has been characterized by Differential Scanning Calorimetry, solid and liquid high resolution NMR spectroscopy. The chemical shift changes using 13C CP/MAS on the complexation of the guest with the host provided significant information on the molecular interactions and they were in agreement with the 2D NOESY results. These results point out that both in solid and liquid forms, the drug is engulfed and interacts with HP-β-CD in identical manner. Molecular dynamics calculations have been conducted to explore the thermodynamic characteristics associated with the silibinin–HP-β-CD interactions and to study the stability of the complex. To approximate the physiological conditions, the aqueous solubility and dissolution characteristics of the complex at pH states simulating those of the upper gastrointestinal tract have been applied. To evaluate and compare the antiproliferative activity of silibinin–HP-β-CD complex with respect to the parent silibinin, MTT assays have been conducted in MCF-7 human cancer cells. Furthermore, p-sulphonatocalix[4]arene has been used as complexing agent for the poorly water soluble quercetin to enhance its solubility and bioavailability. The 1:1 complex formed between p-sulphonatocalix[4]arene and quercetin was confirmed by Job’s plot, solid state NMR and molecular modeling. A gold nanoparticle was then established on the basis of this architectural scaffold which presented enhanced potency against cancer cell lines. Parts of the present thesis were published in the following journals: Molecules [20(3):3868-3897, 2015], Molecular Pharmaceutics [12(3), 954-965, 2015], Expert Opinion in Therapeutic Patents [25(11), 1305-1317, 2015], Current Medicinal Chemistry, [23(1), 36-59, 2016] and Arabian Journal of Chemistry [doi: http://dx.doi.org/10.1016/j.arabjc.2016.11.014]. In addition, I have participated in other scientific projects that have been published in the following journals: BBA–Biomembranes, Comb. Chem. High Throughput Screen., Carbohydrate Res., BBA-General Subjects, Chemico-Biological Interactions, MedChemComm, Int. J. Pharm., J. Agr. Food Chem., J. Biomol. Struct. Dyn., Bioinformatics, J. Mol. Str., Arzneimittelforschung-Drug Research, Platelets.

Στην παρούσα διατριβή, οι διαμορφωτικές ιδιότητες της ολμεσαρτάνης και του μεθυλιωμένου παραγώγου της έχουν μελετηθεί χρησιμοποιώντας ένα συνδυασμό φασματοσκοπίας NMR και μοριακής μοντελοποίησης. Για τα πειράματα μοριακής πρόσδεσης χρησιμοποιήθηκαν τρείς διαφορετικές τρισδιάστατες δομές του υποδοχέα τύπου 1 της αγγειοτασίνης ΙΙ (ΑΤ1R): α) κρυσταλλική δομή, β) ομόλογο μοντέλο με βάση τη τρισδιάστατη δομή του υποδοχέα CXCR4 και γ) ομόλογο μοντέλο με βάση τη ροδοψίνη. Σκοπός της συγκεκριμένης διατριβής ήταν η πιθανή εξήγηση των διαφορών μεταξύ των πειραματικών αποτελεσμάτων των μελετών μεταλλαξιγένεσης στον συγκεκριμένο υποδοχέα και της κρυσταλλικής δομής του συμπλόκου ΑΤ1R-ολμεσαρτάνη. Διεξήχθησαν πειράματα μοριακής δυναμικής για να μελετηθεί η σταθερότητα του συμπλόκου AT1R-αντίστροφου αγωνιστή και τις κύριες αλληλεπιδράσεις κατά τη διάρκεια της πορείας μοριακής προσομοίωσης. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η ολμεσαρτάνη και το μεθυλιωμένο παράγωγο της έχουν παρόμοιες αλληλεπιδράσεις με τα κρίσιμα αμινοξέα εξηγώντας έτσι την σχεδόν πανομοιότυπη δραστικότητα τους in vitro. Παρ’ όλα αυτά μέσω των υπολογισμών μοριακής πρόσδεσης και μοριακής δυναμικής δεν ήταν εφικτό να εξηγηθούν τα αποτελέσματα μεταλλαξιγένεσης, δείχνοντας έτσι ότι το πραγματικό σύστημα είναι αρκετά περίπλοκο και πως η κρυσταλλική δομή και τα ομόλογα μοντέλα δεν δύναται να προσομοιώνουν το πολύπλοκο αυτό περιβάλλον επαρκώς. Πειράματα μοριακής κβαντικής χρησιμοποιήθηκαν για να υπολογισθούν οι χημικές μετατοπίσεις NMR για τις διάφορες διαμορφώσεις της ολμεσαρτάνης και του μεθυλιωμένου παραγώγου της. Οι τιμές αυτές συγκρίθηκαν με τις πειραματικές τιμές εξάγοντας χρήσιμες πληροφορίες για τις βιοδραστικές διαμορφώσεις της ολμεσαρτάνης και του μεθυλιωμένου παραγώγου της. Επιπλέον μέσω υπολογισμών Prime/MMGBSA συγκρίθηκαν οι πόζες και ενέργειες πρόσδεσης της ολμεσαρτάνης και του μεθυλαιθέρα της ολμεσαρτάνης στον AT1R με τρία παράγωγα της ολμεσαρτάνης (R239470, R781253, R794847). Στο δεύτερο μέρος της διατριβής έγινε εκτεταμένη χρήση μεθοδολογιών μοριακής δυναμικής και μοντελοποίησης σε διαφορετικά φυσικά προϊόντα στην προσπάθειά μας να αυξηθεί η βιοδιαθεσιμότητά και η υδατοδιαλυτότητά τους με ενώσεις εγκλεισμού και να χαρακτηρίσουμε την αρχιτεκτονική των αλληλεπιδράσεων στα σύμπλοκα εγκλεισμού. Συγκεκριμένα μελετήθηκαν σε μοριακό επίπεδο οι αλληλεπιδράσεις της σιλιμπινίνης, ενός φαρμάκου που προστατεύει κατά της ηπατοτοξικότητας, με την 2-υδροξυπροπυλο-β-κυκλοδεξτρίνη (HP-β-CD). Το σύμπλοκο εγκλεισμού της σιλιμπινίνης με την HP-β-CD χαρακτηρίστηκε με Διαφορική Θερμιδομετρία Σάρωσης, και φασματοσκοπία NMR υγρής και στερεής κατάστασης. Οι μεταβολές στις χημικές μετατοπίσεις του συμπλόκου εγκλεισμού που χαρτογραφήσαμε, χρησιμοποιώντας 13C CP/MAS, παρέχουν σημαντικές πληροφορίες για τις μοριακές αλληλεπιδράσεις και ήταν σε άριστη συμφωνία με τα αποτελέσματα 2D NOESY. Τα αποτελέσματα αυτά επισημαίνουν πως το μόριο έχει ενσωματωθεί εντός της κοιλότητας της HP-β-CD και αλληλεπιδρά με παρόμοιο τρόπο σε υγρή και στερεή μορφή. Τα θερμοδυναμικά χαρακτηριστικά του συμπλόκου σιλιμπινίνη-HP-β-CD και η σταθερότητα του μελετήθηκαν μέσω υπολογισμών μοριακής δυναμικής. Η διαλυτότητα του συμπλόκου σε νερό καθώς και τα χαρακτηριστικά της διαλυτότητας υπολογίσθηκαν σε pH που προσομοιώνει το άνω γαστρεντερικό σύστημα, για να προσεγγισθούν οι φυσιολογικές συνθήκες. Η αντιπολλαπλασιαστική επίδραση του συμπλόκου σιλιμπινίνη–HP-β-CD συγκρίθηκε με εκείνη της σιλιμπινίνης σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα MCF-7 μέσω δοκιμών MTT.Επίσης, προς την ίδια κατεύθυνση, χρησιμοποιήθηκε το p-σουλφονατο καλιξ[4]αρένιο ως παράγοντας εγκλεισμού για την αύξηση της υδατοδιαλυτότητας και βιοδιαθεσιμότητα της κερκετίνης. Η στοιχειομετρία του συμπλόκου καλιξαρενίου-κερκετίνης επιβεβαιώθηκε πως είναι 1:1 με την χρήση διαφορετικών μεθόδων (φασματοσκοπία UV, Job plot, φασματοσκοπία NMR στερεής κατάστασης και μοριακής μοντελοποίησης). Μέρος της παρούσας διδακτορικής διατριβής έχει δημοσιευθεί στα περιοδικά: Molecules [20(3):3868-3897, 2015], Molecular Pharmaceutics [12(3), 954-965, 2015], Expert Opinion in Therapeutic Patents [25(11), 1305-1317, 2015], Current Medicinal Chemistry, [23(1), 36-59, 2016], Arabian Journal of Chemistry [doi: http://dx.doi.org/10.1016/j.arabjc.2016.11.014]. Επίσης παράλληλα συμμετείχα σε άλλα ερευνητικά προγράμματα κατά τη διάρκεια των οποίων δημοσίευσα στα πιο κάτω περιοδικά: BBA–Biomembranes, Comb. Chem. High Throughput Screen., Carbohydrate Res., BBA-General Subjects, Chemico-Biological Interactions, MedChemComm, Int. J. Pharm., J. Agr. Food Chem., J. Biomol. Struct. Dyn., Bioinformatics, J. Mol. Str., Arzneimittelforschung-Drug Research, Platelets.