The role of Rho family GTPases in human cytomegalovirus infection

Abstract

Human cytomegalovirus (HCMV) is one of the eight human herpesviruses with worldwide distribution and a high clinical importance. It is a beta herpes virus with double stranded DNA and establishes a lifelong latent infection after a primary infection. Rho GTPases are crucial regulators of the actin cytoskeleton and play a role in controlling membrane trafficking and cell signaling. The actin cytoskeleton of the host cell and actin regulating Rho GTPase signaling pathways are involved in several of the interactions of human cells with viral components. This has provided scientific data so as to investigate further on the Human Cytomegalovirus (HCMV). So far, there is short evidence on the role of Rho GTPases during HCMV infection. In the present thesis, we studied the mechanism that controls infection by HCMV investigating two directions; the effect of RhoA and the role of RhoA depletion during the course of infection and the effect of silencing RhoA, RhoB or RhoC in HCMV infected glioblastoma cells. The first part of this thesis focused in the analysis of the effect of RhoA silencing during the various early and late stages of HCMV infection to establish whether RhoA and RhoA downstream effectors are directly involved in promoting productive HCMV infection. Therefore it was of high priority to investigate the effect of RhoA and the role of RhoA knockdown at the early stages of infection that occur immediately after viral uptake into the host cell as well at the later stages during viral egress. Collectively, it was demonstrated that RhoA knockdown provides benefit to early and late stages of HCMV infection by the inhibition of the RhoA and ROCK1 pathway. At the second part of the study, we analyzed modifications in the organization of the actin cytoskeleton that are regulated by RhoA, RhoB and RhoC GTPases and affect cell motility and migration in HCMV infected cancer cells in order to explore properties of HCMV and its capability to modulate the tumor microenvironment. Taken together these data, we suggest a possible direct or indirect involvement of Rho small GTPases during HCMV infection with potential role in cell morphology, proliferation and migration of human glioblastoma cells.

Ο ανθρώπινος κυτταρομεγαλοϊός (HCMV) είναι ένας από τους οχτώ ανθρώπινους ερπητοϊούς με ευρεία κατανομή ανά τον κόσμο και μεγάλη κλινική σημασία. Είναι ένας β-ερπητοϊός με διπή έλικα DNA που επιτυγχάνει μακροχρόνια λανθάνουσα φάση μετά από την πρωτογενή μόλυνση. Οι Rho GTPάσες είναι σημαντικοί ρυθμιστές της ακτίνης του κυτταροσκελετού και παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της μεμβρανικής μεταφοράς και της κυυταρικής σηματοδότησης. Η ακτίνη του κυτταροσκελετού του κυττάρου ξενιστή καθώς επίσης και τα σηματοδοτικά μονοπάτια των Rho GTPασών που αυτή ρυθμίζει, εμπλέκονται στις αλληλεπιδράσεις των κυττάρων του ανθρώπου με ιικά στοιχεία. Αυτά τα επιστημονικά δεδομένα μας παρείχαν το έναυσμα για να μελετήσουμε αυτές τις αλληλεπιδράσεις στο πλαίσιο μόλυνς ης από τον HCMV. Παρ’ όλα αυτά, υπάρχουν περιορισμένες μελέτες όσον αφορά το ρόλο των Rho GTPασών στη διάρκεια μόλυνσης από τον HCMV. Στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής διερευνήθηκαν οι μηχανισμοί που διέπουν τη μόλυνση από τον ανθρώπινο κυτταρομεγαλοϊό (HCMV). Συγκεκριμένα, διερευνήθηκε η δράση της RhoA GTPάσης και ο ρόλος της αποσιώπησής της στην έκβαση της μόλυνσης από τον HCMV. Επιπλέον, διερευνήθηκε η δράση των RhoA, RhoB και RhoC GTPασών και ο ρόλος της αποσιώπησής τους σε μολυσμένα από τον HCMV καρκινικά κύτταρα. Στο πρώτο σκέλος της διατριβής διερευνήθηκαν τα φαινόμενα που προκαλεί η αποσιώπηση της RhoA GTPάσης στα πρώιμα και όψιμα στάδια της μόλυνσης από τον HCMV, με σκοπό να προσδιοριστεί ο ρόλος της RhoA GTPάσης καθώς επίσης και των ρυθμιστικών της παραγόντων στην αποτελεσματική έκβαση της μόλυνσης από τον ανθρώπινο κυτταρομεγαλοϊό. Για το σκοπό αυτό μελετήσαμε το ρόλο της συγκεκριμένης GTPάσης στα πρώιμα στάδια της μόλυνσης που αρχίζουν με την πρόσληψη του ιού από το κύτταρο ξενιστή, καθώς επίσης και το ρόλο της RhoA GTPάσης στα όψιμα στάδια της μόλυνσης κατά τη διάρκεια των οποίων ο ιός εξέρχεται από το κύτταρο. Συνολικά, η αποσιώπηση της RhoA GTPάσης επιταχύνει τα διάφορα στάδια της μόλυνσης από τον HCMV μέσω της καταστολής του RhoA και ROCK1 σηματοδοτικού μονοπατιού. Ως προς το δεύτερο σκέλος της εργασίας, διερευνήθηκαν οι αλλαγές στην οργάνωση της ακτίνης του κυτταροσκελετού που προκαλούνται από τις RhoA, RhoB και RhoC GTPάσες και ρυθμίζουν την κυτταροκίνηση και τις μεταναστευτικές ιδιότητες μολυσμένων από τον HCMV καρκινικών κυττάρων. Με αυτό το τρόπο μπορέσαμε να καθορίσουμε τις ογκοτρόπες δράσεις του HCMV καθώς επίσης και τη ικανότητά του να ρυθμίζει το μικροπεριβάλλον του καρκίνου. Συλλεγοντας όλα τα δεδομένα αυτού του σκέλους της εργασίας, προτείναμε μία άμεση ή έμμεση επίδραση των Rho GTPασών στη μορφολογία, τον πολλαπλασιασμό και τη μεταναστευτική ικανότητα μολυσμένων από τον HCMV κυττάρων γλοιοβλαστώματος.