Ο ρόλος των δενδριτικών κυττάρων στη χρονιότητα της ηπατίτιδας C

Abstract

In the present thesis we examined the functions of monocyte-derived DC (MDDC), generated from patients with chronic hepatitis C (CHC), against the same parameters of DC generated from healthy subjects. We observed a defect in DC, generated from CHC patients, capacity to stimulate ‘naïve’ CD4+ T-cells into proliferation, in Mixed Lymphocyte Reactions (MLR). We further investigated other parameters of DC function and in particular, the production of IL-12, the expression on DC surface of CD40, CD80, CD83, CD86, HLA DR and we tried to correlate them with virus- and patient- specific characteristics. We observed statistically significant stimulatory effect of HCV viraemia and antigenaemia on DC immune-phenotype and on DC allostimulatory capacity. The presence of HCV specific sequences and in particular “positive” and “negative” strand HCV RNA and of HCV proteins (HCV core) inside the DC did not appear to influence DC function. A negative effect on DC IL-12 secretion was seen in “heavy drinkers” (>24units of ethanol/week). We further studied the effect of the anti-viral treatment on DC function, assuming restoration of DC reactivity as a result of therapy. We observed increased induction of IFN-γ production from autologous CD4+ T-lymphocytes in patients achieving undetectable viraemia by treatment week 12 and we showed evidence, by implementing “cross-over” experiments, that the observed improvement in autologous reactivity was possibly due to DC function restoration post-treatment. In a quite crude first attempt at accessing plasmacytoid dendritic cell (pDC) contribution to anti-HCV immunity we infected pDC from healthy donors with HCV plasma and we subsequently tested their capacity to produce various cytokines both Th1 and Th2-skewing, namely: IFN-α, IL-6 and IL-12 as compared to cytokine secretion elicited by “positive” markers: a. TLR 7/8 ligand), b. HBV serum and c. TLR 9 ligand . We showed evidence of simultaneous induction of IFN-α secretion and reduced IL-12 production related to HCV infection. Testing the effect of antiviral drug Ribavirin on pDC we came across a spectacular induction of IL-12 secretion, for the first time in the literature, adding one more potential mechanism of the antiviral capacity of the drug. In summary our data overall: 1. add evidence to the negative effect of HCV on DC function, 2. indicate improvement of DC function as a result of viraemia clearance after antiviral treatment, an improvement that eventually restores adaptive antiviral responses, 3. point towards low-grade active HCV replication inside DC without an effect on DC function, probably as a trick HCV uses to escape antiviral immunity by exploiting the “immunological safe-haven” of the DC endosomal compartments, 4. show induction of IFN-a production along with reduced IL-12production by pDC in the setting of HCV infection and finally 5. indicate one more potential mechanism of the antiviral effect of Ribavirin that of IL-12 induction from pDC.

Ο ρόλος του ενδογενούς ανοσιακού συστήματος και ιδιαίτερα των δενδριτικών κυττάρων στην εγκατάσταση χρόνιας ηπατίτιδας C, έχει μελετηθεί τα τελευταία χρόνια. Ωστόσο δεν υπάρχει συμφωνία σχετικά με πιθανή δυσλειτουργία των δενδριτικών κυττάρων στα πλαίσια της HCV λοίμωξης. Στην παρούσα διατριβή αρχικά παρατηρήσαμε έλλειμμα στην ικανότητα των DC από ασθενείς με χρόνια ηπατίτιδα C να προάγουν τον πολλαπλασιασμό “naïve” CD4+ T-λεμφοκυττάρων. Χρησιμοποιώντας ως αφετηρία αυτή την παρατήρησή μας μελετήσαμε περαιτέρω και άλλες λειτουργικές παραμέτρους των DC όπως η έκκριση IL-12 και η έκφραση επί των DC CD40, CD80, CD83, CD86, και HLA DR, αναζητώντας παράγοντες σχετιζόμενους με τον HCV ή με τα χαρακτηριστικά των μελετηθέντων ασθενών που επηρεάζουν τις παραμέτρους αυτές. Διαπιστώσαμε στατιστικά σημαντική διεγερτική επίδραση της HCV ιαιμίας και αντιγοναιμίας επί του ανοσοφαινότυπου των DC αλλά και επί της αλλοδιεγερτικής ικανότητας τους. Αντίθετα η παρουσία HCV γονιδιώματος αλλά και αντιγόνων του ιού εντός των DC δεν φάνηκε στα πειράματά μας να επηρεάζει τη λειτουργία των τελευταίων. Αρνητική επίδραση επί της έκκρισης IL-12 από τα DC παρατηρήσαμε σε ασθενείς με αυξημένη κατανάλωση αλκοόλ. Επίσης μελετήσαμε την επίδραση της αντι-ιϊκής θεραπείας επί της λειτουργικότητας των DC με την υπόθεση της βελτίωσής της μετά τον φαρμακευτικό έλεγχο της ιαιμίας. Όντως σε ασθενείς που πέτυχαν μη-ανιχνεύσιμα επίπεδα του HCV μέχρι τη 12η εβδομάδα της θεραπείας παρατηρήσαμε αυξημένη ικανότητα παραγωγής και έκκρισης IFN-γ από αυτόλογα CD4+ T-λεμφοκύτταρα. Για να διαχωρίσουμε ωστόσο τη συμβολή της βελτίωσης της λειτουργικότητας των DC από τη θεραπεία έναντι της βελτίωσης της επίκτητης ανοσίας δοκιμάσαμε DC και CD4+ T-λεμφοκύτταρα πριν και μετά τη θεραπεία, σε συν-καλλιέργειες, σε όλους τους δυνατούς συνδυασμούς, σε ασθενείς οι οποίοι εμφάνισαν μη-ανιχνεύσιμο HCV RNA στο τέλος της 12ης εβδομάδας της θεραπείας. Από αυτά τα πειράματά μας προέκυψαν σημαντικές ενδείξεις βελτίωσης της λειτουργικότητας των DC και όχι των CD4+ Τ-λεμφοκυττάρων. Σε μια αρχική απόπειρα εκτίμησης της συμβολής των pDC στην αντι-HCV ανοσία επιμολύναμε pDC από υγιείς εθελοντές με πλάσμα ασθενούς με υψηλή HCV ιαιμία και μελετήσαμε την έκκριση IFN-α, IL-6 και IL-12 από αυτά συγκρίνοντάς την με την αντίστοιχη έκκριση που προκλήθηκε από a. TLR 7/8 ligand, b. ορό ασθενούς με υψηλή HBV ιαιμία και c. TLR 9 ligand. Διαπιστώσαμε ενδείξεις κατασταλτικής επίδρασης από την μία μεριά επί της έκκρισης IL-12p70 και από την άλλη επαγωγικής της έκκρισης IFN-α, από τον HCV. Τέλος μελετήσαμε την επίδραση της Ριμπαβιρίνης επί των pDC και αναγνωρίσαμε για πρώτη φορά στη βιβλιογραφία την διεγερτική επίδραση θεραπευτικών συγκεντρώσεων Ριμπαβιρίνης επί της έκκρισης IL-12. Επιγραμματικά θα μπορούσαμε να πούμε ότι τα δεδομένα της παρούσας διατριβής προσθέτουν μαρτυρία: 1. στον αρνητικό επηρεασμό της λειτουργίας των DC από τον HCV, 2. στην αποκατάσταση της λειτουργίας των DC στα πλαίσια της αντιϊκής θεραπείας και στην επακόλουθη βελτίωση της επίκτητης αντι-HCV ανοσίας, 3.στην παρατήρηση ότι η παρουσία του ιού εντός των DC δεν επηρεάζει τη λειτουργία τους, 4. στην επαγωγή έκκρισης IFN-α και στην μειωμένη έκκριση IL-12 από τα pDC στα πλαίσια της λοίμωξης από τον HCV και τέλος 5. αναδεικνύουν για πρώτη φορά στη βιβλιογραφία την ευεργετική επίδραση της αντι-ιϊκής θεραπείας, και συγκεκριμένα της Ριμπαβιρίνης, επί των pDC και ιδιαίτερα επί της έκκρισης IL-12 από τα τελευταία.