Διερεύνηση του ρόλου των φλεγμονοσωμάτων στην παθογένεια της πνευμονικής ίνωσης

Abstract

The primary pathogenetic event of idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) remains uncertain, despite increased clinical and scientific research in recent years. The median survival from the time of diagnosis is 3 years and explains why IPF is currently considered more lethal than many cancers .The radiologic and histopathologic pattern of IPF is that of usual interstitial pneumonia (UIP) . UIP, unlike the other collagen tissue disorders, is also the most frequent pattern when interstitial lung involvement occurs in patients with rheumatoid arthritis (RA-UIP) . RA-UIP and IPF present some rather intriguing similarities at the clinical and molecular level. Therefore, it is critical to identify initiating events that may drive the pathogenesis of lung fibrosis, both IPF and autoimmune lung fibrosis, with the histologic or radiologic appearance of UIP especially now that we have officially entered a new erawith two new agents able to slow IPF progression. Inflammasomes are multimolecular protein complexes responsible for caspase-1-driven activation of the pro-inflammatory cytokine interleukin (IL)-1β . They are involved in the innate immunity by recognising pathogen-associated molecular patterns (PAMPs; on bacteria, viruses and fungi), and intracellular and extracellular damage-associated molecular patterns. Furthermore, innate immunity mechanisms have been proposed to have a fundamental role in the initiation of IPF, mainly through the activation of Toll-like receptor (TLR)-9, which drives the rapid progression of fibrotic lung disease through the differentiation of pulmonary fibroblasts into myofibroblasts. NLRP3 activation could also be impaired in IPF, as is the innate immune response to bacteria and virus infections in IPF fibroblasts and macrophages.Previous studies in animal models have shown that stimulation with asbestos, bleomycin, silica and statins activates inflammasomes and ultimately the production of active IL-1β, which stimulates the production of transforming growth factor (TGF)-β, a central mediator of the development of lung fibrosis, via fibroblast proliferation, collagen production and inhibition of fibroblast apoptosis. Interestingly, it has been postulated that pharmacologically induced NLRP3 activation leads to interstitial lung disease.Caspase-1 activity has also been directly linked to systemic sclerosis-related fibrosis, which suggests that autocrine signalling mediated by IL-1β and IL-18 promotes the pro-fibrotic phenotype observed in these patients. Moreover, NLRP3 inflammasome activation has been linked to neutrophilic asthma ], while inflammasome-regulated cytokines are critical mediators of acute lung injury. Alternatively, a recent report suggests that the NLRP3 inflammasome pathway is not linked to the severity of stable chronic obstructive pulmonary disease following analyses in the bronchoalveolar lavage fluid (BALF) andcellular components. Recent evidence showing a possible activation of NLRP3 by cigarette smoking, another environmental risk factor for both IPF and rheumatoid arthritis, further supports the possible implication of inflammasomes in lung fibrosis. The role of IL-1β has emerged in the pathogenesis of cigarette smoke-induced emphysema and small airway remodelling.In the current study, we sought to investigate whether NLRP3 inflammasomes are involved in the pathogenesis of lung fibrosis in idiopathic (IPF) and autoimmune (RA-UIP) lung diseases. We used IL-1β and IL-18 cytokine expression in BALF and BALF macrophage cultures as surrogate markers of NLRP3 activation. Our findings suggest distinct inflammasome activation profiles between autoimmune lung fibrosis and IPF. The current study investigated the activation of the NLRP3 pathway in BALF from patients with IPF and RA-UIP at baseline and following NLRP3 inflammasome activation.Our findings suggest distinct inflammasome activation profiles between autoimmune lung fibrosis and IPF.Overall, our results suggest that inflammasome activation is severely impaired in IPF BALF macrophages. Furthermore, the inflammasome activation profile is distinct in RA-UIP, since IL-1β and IL-18 levels are already high at baseline, albeit upregulation is still possible, as shown by the further increase in the newly produced intracellular mature IL-1β levels following LPS plus ATP treatment. Inflammasomes are activated in RA-UIP lung. We observed that IL-1β and IL-18 levels were elevated in RA-UIP BALF. IL-1β and IL-18 are, at least in part, secreted by alveolar macrophages since we observed that the unstimulated macrophage cultures produced significantly higher levels of these cytokines as compared with controls. In addition, mRNA levels of other components of the NLRP3 pathway such as NLRP3 and caspase-1 were also upregulatedRA-UIP-derived BALF cells. Impaired activation of the NLRP3 inflammasome in IPF. In IPF, in contrast to RA-UIP, we observed only slightly higher levels of IL-1β in the BALF relative to controls, while cultured BALF cells secreted slightly lower IL-1β levels than controls. In both cases, however, IL-1β levels were significantly lower when compared with RA-UIP samples. Intriguingly, in IPF, similarly to RA-UIP samples, baseline NLRP3 and caspase-1 expression in cultured BALF macrophages as well as IL-18 and IL-6 levels were higher than in the controls.The main finding of this work is that alveolar macrophages from IPF patients exhibited impaired responses to LPS stimulation and LPS/ATP co-stimulation, leading to the hypothesis that both TLR-4 and NLRP3 inflammasome pathways are dysregulated. In particular, we observed no NLRP3-specific induction of either intracellular or secreted IL-1β in alveolar macrophage cultures in IPF, while the induction of IL-18 was significantly lower in IPF relative to RA-UIP and controls.Our observations are in agreement with cumulative evidence that the innate immune response is impaired in patients with IPF, including the reduced functional capacity of macrophages to kill bacteria . Our present findings suggest that deregulation of inflammasome activation in fibrotic patients could be crucial in the progression of the disease, in particular with respect to the occurrence of acute exacerbations. Immune mechanisms have been implicated in IPF and are also central to the development of rheumatoid lung. However, autoimmunity in IPF needs to be interpreted with caution, as it could provide a possible future therapeutic target. Our study provides further evidence for the association of innate immunity with IPF; however, this effect is more prominent, as expected, in rheumatoid lung.As the inflammasome plays a central role in host defence against wide variety of infectious and noninfectious agents, this finding further supports the dysregulation of the innate immune response of IPF patients which has been linked to the pathogenesis of IPF and in particular the inability of these patients to resolve lung infections linked to acute exacerbations.The importance of inflammation in initiation and progression of pulmonary fibrosis has already been established , while the initial pro-inflammatory scenario of inflammasome activation can rapidly progress to a fibrotic one. Our findings reveal a significant lapse in NLRP3 inflammasome activation in alveolar macrophages in IPF, while suggesting an impaired activation of NLRP3 in autoimmune fibrosis, compared with healthy macrophages. It is thus imperative to explore all possible pathological and therapeutic implications of inflammasomes in the fibrotic lung.

Η ίνωση είναι μια παθολογική κατάσταση που χαρακτηρίζεται από την αυξημένη παραγωγή και τη μειωμένη αποικοδόμηση συστατικών του εξωκυττάριου στρώματος, κυρίως κολλαγόνου. Τα κύτταρα που είναι υπεύθυνα για την παραγωγή του κολλαγόνου, και επομένως έχουν κεντρικό ρόλο στη διαδικασία της ινωγένεσης, είναι οι μυοϊνοβλάστες. Από άποψη μοριακού μηχανισμού, η ίνωση παρουσιάζει μεγάλες ομοιότητες με το μηχανισμό επούλωσης τραυμάτων. Ο μηχανισμός επούλωσης περιλαμβάνει μια αρχική φάση φλεγμονής, μια φάση πολλαπλασιασμού των μυοϊνοβλαστών και αύξησης της παραγωγής κολλαγόνου και τέλος την αναγέννηση του ιστού που συνοδεύεται από την απόπτωση των μυοϊνοβλαστών και την αποικοδόμηση της περίσσειας του κολλαγόνου. Στην ίνωση, οι μυοϊνοβλάστες παραμένουν ενεργοί και η παραγωγή κολλαγόνου συνεχίζεται με αποτέλεσμα την καταστροφή της δομής και τελικά την απώλεια της λειτουργικότητας του ιστού. Ίνωση μπορεί πρακτικά να εκδηλωθεί σε όλους τους ανθρώπινους ιστούς. Κατά συνέπεια, αν και υπάρχουν ινωτικοί μηχανισμοί που είναι κοινοί για όλους τους ιστούς, υπάρχουν ταυτόχρονα σημαντικά χαρακτηριστικά που παρουσιάζουν ιστοεξειδίκευση. Τα τελευταία χρόνια, η προέλευση των μυοϊνοβλαστών είναι ένα από τα χαρακτηριστικά που έχει αρχίσει να θεωρείται ότι παρουσιάζει ιστοεξειδίκευση αφού πιθανές πηγές των μυοϊνοβλαστών έχει αποδειχθεί ότι μπορούν να είναι διάφοροι κυτταρικοί πληθυσμοί όπως το επιθήλιο, το ενδοθήλιο, κύτταρα του μυελού των οστών, προϋπάρχοντες ινοβλάστες και μυοϊνοβλάστες, λιποαποταμιευτικά κύτταρα κλπ. Η παρούσα μελέτη επικεντρώνεται στην ίνωση του πνευμονικού ιστού αφού η ίνωση του πνεύμονα αποτελεί κοινό χαρακτηριστικό μιας μεγάλης οικογένειας ασθενειών, των νόσων του διάμεσου πνευμονικού χώρου. Η συνηθέστερη από τις ασθένειες αυτές είναι η ιδιοπαθής πνευμονική ίνωση ενώ οι μοριακοί μηχανισμοί που ρυθμίζουν την εκδήλωση και την εξέλιξη της νόσου παραμένουν άγνωστοι. Η παθογένεια της ιδιοπαθούς και αυτοάνοσης πνευμονικής ίνωσης παραμένει αινιγματική. Επαναλαμβανόμενοι κύκλοι επιθηλιακού τραυματισμού, ινοβλαστική δραστηριότητα και ανώμαλη επούλωση αποτελούν τα κύρια γεγονότα. Αρκετοί παράγοντες όπως γενετικές και επιγενετικές ανωμαλίες, λοιμώξεις, κυτταροκίνες και αυξητικοί παράγοντες, αυξημένο οξειδωτικό στρες, αυτοαντισώματα, περιβαλλοντική έκθεση, γαστροοισοφαγική παλινδρόμηση έχουν ενοχοποιηθεί για την έναρξη και εξέλιξη των διάχυτων διάμεσων πνευμονοπαθειών- interstitial lung diseases ILDs. Το πιο συχνό ιστολογικό πρότυπο της πνευμονικής ίνωσης είναι η συνήθης διάμεση πνευμονία και η μη ειδική διάμεση πνευμονία με την πρώτη να υπερτερεί στις ιδιοπαθείς διάμεσες πνευμονίες (με κύριο εκπρόσωπο την Ιδιοπαθή Πνευμονική ίνωση, IPF) και την δεύτερη να υπερτερεί στις διάμεσες πνευμονίες που σχετίζονται με νοσήματα του συνδετικού ιστού, εκτός από τη ρευματοειδή αρθρίτιδα στην οποία το όποιο το πρότυπο της συνήθους διάμεσης πνευμονίας (UIP) υπερέχει. Πρόσφατα δεδομένα έδειξαν ένα σημαντικό ρόλο που έχουν τα φλεγμονοσώματα στην ανάπτυξη της πνευμονικής ίνωσης.Τα φλεγμονοσώματα είναι πολυμοριακά συμπλέγματα πρωτεϊνών υπεύθυνα για την ενεργοποίηση της κασπάσης 1, μιας πρωτεάσης που απαιτείται για την ενεργοποίηση και παραγωγή της προφλεγμονώδους κυτταροκίνης ιντερλευκίνης-1β (IL-1β). Αποτελούνται από ένα αισθητήρα, ο οποίος είναι ένας κυτταροπλασματικός υποδοχέας, μια πρωτεΐνη προσαρμογής και μια δραστική πρωτεΐνη που είναι η κασπάση-1. Μελέτες, κυρίως σε πειραματόζωα, έδειξαν πως τα φλεγμονοσώματα μπορούν να συνεισφέρουν στην παθογένεια της πνευμονικής ίνωσης και των αυτοάνοσων νοσημάτων. Εν τούτοις, ο ρόλος τους δεν έχει ακόμη διευκρινιστεί. O ρόλος της φλεγμονής στην παθογένεια της πνευμονικής ίνωσης είναι αμφιλεγόμενος. Για το σκοπό αυτό, υποθέτουμε πως διαφορές στα φλεγμονώδη προφίλ μεταξύ συνήθους διάμεσης πνευμονίας-usual interstitial pneumonia (UIP) και μη ειδικής διάμεσης πνευμονίας-non specific interstitial pneumonia (NSIP) θα μπορούσαν να εξηγήσουν διαφορές στην παθογένεση, πρόγνωση και ανταπόκριση στη θεραπεία. Εκτιμήσαμε την έκφραση διαφόρων συστατικών των φλεγμονοσωμάτων καθώς και της IL-1β, μιας φλεγμονώδους κυτταροκίνης της οποίας η παραγωγή ελέγχεται από τα φλεγμονοσώματα, στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα Bronchoalveolar lavage (BALF) ασθενών με ιδιοπαθή πνευμονική ίνωση-Idiopathic Pulmonary Fibrosis (IPF), ρευματοειδή αρθρίτιδα-rheumatoid arthritis (RA)/(UIP). Αν και έχει παρατηρηθεί πως οι διάμεσες πνευμονίες που σχετίζονται με νοσήματα του συνδετικού ιστού-collagen tissue disorders (CTDs) έχουν καλύτερη πρόγνωση από αυτή των ιδιοπαθών τους μορφών πρόσφατα έχει φανεί πως ασθενείς με RA-UIP έχουν παρόμοια πρόγνωση με την ιδιοπαθή πνευμονική ίνωση, το κλινικό πρότυπο της ιδιοπαθούς συνήθους διάμεσης πνευμονίας που αποτελεί τον πιο καταστροφικό τύπο των ιδιοπαθών διάμεσων νοσημάτων με μια μέση επιβίωση τα τρία έτη. Η ιδιοπαθής πνευμονική ίνωση έχει επίσης χειρότερη πρόγνωση από την ιδιοπαθή μη ειδική διάμεση πνευμονία, ενώ καμία διαφορά στην πρόγνωση δεν παρατηρείται ανάμεσα στην non CTD-UIP και CTD-NSIP. Στις μέχρι τώρα γνώσεις μας αυτή είναι η πρώτη προσπάθεια να εκτιμήσουμε τον ρόλο των φλεγμονοσωμάτων στην παθογένεια της ίνωσης χρησιμοποιώντας το βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα ασθενών με ιδιοπαθή και αυτοάνοση ίνωση.Η ενεργοποίηση των φλεγμονοσωμάτων οδηγεί, μέσω ενεργοποίησης της κασπάσης-1, την έκκριση ώριμης μορφής της ΙL-1β. Τα φλεγμονοσώματα συνθέτονται μέσω ενεργοποίησης των συστατικών των κυτταροπλασματικών υποδοχέων τους. Τρία από αυτά ανήκουν στην οικογένεια των NOD Like υποδοχέων-NOD Like Receptors (NLRs) και ονομάζονται NLRP1, NLRP3 και NLRC4, όπου μαζί με τους Toll Like υποδοχείς-Toll Like Receptors (TLRs) και τους RIG-I-like υποδοχείς RIG-I-like receptors (RLRs) αποτελούν συστατικά κλειδιά για την αρχική ανοσία αποτελώντας την πρώτη γραμμή άμυνας του ξενιστή ενάντια σε εξωγενή και ενδογενή ερεθίσματα. Εάν ο μηχανισμός αυτός αποτύχει να εξαλείψει τα τραυματικά ερεθίσματα, αυτά επιμένουν και οδηγούν σε χρόνια φλεγμονή που μπορεί να εξελιχθεί σε ίνωση.Η παραγωγή της IL-1β, σε αντίθεση με τις άλλες κυτταροκίνες, ελέγχεται από δύο σήματα. Tο πρώτο προέρχεται από τους TLRs, οι οποίοι ενεργοποιούν μια NF-kB–εξαρτώμενη pro–IL-1b έκφραση και το δεύτερο προέρχεται από τα φλεγμονοσώματα. Η IL-1β συμμετέχει σε οξείες και χρόνιες φλεγμονώδεις διαταραχές. Αρκετές μελέτες κυρίως σε πειραματόζωα, έχουν προσπαθήσει να ερμηνεύσουν τη συμμετοχή των φλεγμονοσωμάτων στην παθογένεια της ίνωσης. Πρόσφατα παρατηρήθηκε πως κρύσταλλοι πυριτίου και αμιάντου, που ενοχοποιούνται για την πρόκληση ίνωσης, περιβάλλονται από μακροφάγα, ενεργοποιούν τα NLRP3 φλεγμονοσώματα προκαλώντας την παραγωγή IL-1b ενώ η έλλειψη σε NLRP3 στα ποντίκια οδήγησε στη δημιουργία εκτεταμένης φλεγμονής, σχηματισμό κοκκιώματος και ίνωση μετά από έκθεση σε πυρίτιο και αμίαντο.Η παραγωγή της NLRP3-dependent IL-1β ενοχοποιείται επίσης για την πνευμονική ίνωση οφειλόμενη στην μπλεομυκίνη. Η θεραπεία με μπλεομυκίνη στα ποντίκια οδηγεί σε έκκριση ουρικού οξέως μέσω των νεκρών κυττάρων που διεγείρουν την ενεργοποίηση των NLRP3 φλεγμονοσωμάτων, και η πνευμονική ίνωση μειώνεται δραματικά μετά τη θεραπεία των ποντικών με τον ανταγωνιστή υποδοχέα της IL-1, το ανακίνρα σε συνδυασμό με αλοπουρινόλη. Η IL-1β ενοχοποιείται επίσης για την παθογένεια αυτοάνοσων νοσημάτων όπως η RA. Στις αρθρικές βιοψίες ασθενών με ρευματοειδή αρθρίτιδα, η IL-1β βρέθηκε σε περιοχές με μακροφάγα και ινοβλάστες. Επιπλέον, πολυμορφισμοί της IL-1 μπορεί να ενοχοποιούνται για προδιάθεση στην συστηματική σκλήρυνση systemic sclerosis (SSc).Συμπερασματικά τα αποτελέσματα μας δείχνουν ενεργοποίηση του NLRP3 δια μέσω της αυξημένης έκφρασης της IL-1β στη RA-UIP. Αντιθέτως παρατηρήθηκε διαταραχή στη λειτουργία του φλεγμονοσώματος στην IPF. Το φλεγμονόσωμα NLRP3 μπορεί να συμμετέχει στην παθογένεια της RA-UIP και της IPF δια μέσω όμως διαφορετικών μηχανισμών.