Μελέτη της έκφρασης των κοινών οδών των γονιδίων in vitro και in vivo στους όγκους του κεντρικού νευρικού συστήματος για την ανεύρεση αιματολογικών δεικτών

Abstract

Human neoplasias are becoming an epidemic. The etiology of tumorigenesis is still unknown.Several theories have been proposed throughout time for the possible causes of tumors but none,still, explains in full the occurrence of this disease. Especially, for the case of childhoodneoplasias, these are more important since they affect a sensitive part of the population. Themajority of childhood neoplasias occur as hematologic malignancies such as AcuteLymphoblastic Leukemia (ALL) which is the most common in children. In the case of ALL, hugeprogress has been made since survival rates reach a 75%-80%. This is an amazing progress in thecase of ALL, if we consider the fact that the disease was lethal in the 90% of cases just 40 yearsago. Yet, in the case of ALL, there is still a 10-20% that relapses. The etiology of relapse is stillunknown since the tumorigenic machinery is very complicate.The case of Central Nervous System (CNS) tumors is much more complicated. Survival rates arevery low and usually life expectancy does not exceed 2-3 years. Brain tumors are interesting fortwo reasons. The first is that the brain does not have cells that proliferate; at least as much asother cells do in the human body, and the second is that the function of the brain itself is still achallenge.The main focus in research has been given to the understanding of the mechanisms thatunderlie tumorigenesis, the discovery of prognostic factors and in general the classification oftumors and brain tumors in particular into distinct types that would add to the knowledge ofbetter treatments.The main dogma in research consisted from the formulation of a hypothesis and its subsequentconfirmation with experimental procedures. With the advent of high-throughput methodologiesa new approach started namely the discovery-driven research.The application of such technologies has been proven useful in the classification ofdisease i.e. tumors, which yielded better results than the classical methods. This was due to thefact that older methods took into account few factors at a time, such as gene expression ofgenomic polymorphism. Yet, high-throughput methodologies have not helped us much with theunderstanding of disease machinery because of the extreme complexity of the investigatedphenomena.At the same time, it is true that there is a tendency towards the so called patient-specifictreatment or personalized medicine nowadays. This approach aims in identifying key factors thatdiscriminate patient as far as treatment and prognosis are concerned, since it is also true thatsimilar diseases can be as diverse as the persons carrying those. However, that present approachrelies and heads towards a direction opposite to the personalized directive. It aims in discovering similar i.e. global factors that would determine tumorigenesis and tumour progression. The ideabehind it is that since the tumorigenic phenotype is the same that is uncontrollable proliferation,apoptosis evasion and others, there should be, down to the bottom-line, a similar mechanismdriving all these forces. We use for this purpose four tools: the first is experimentation, thesecond is systems theory the third is chaos and nonlinear dynamics and the fourth is physicalbiology. We could not describe it in better way for each of these approaches than some giants ofscience have already mentioned it. The first are the words of the universal genius, a 19th centurymathematician Henri Poincaré:“…life is a relationship among molecules and not a property of any molecule…”“…Science is built up of facts, as a house is with stones. But a collection of facts is no more a science, than a heapof stones is a house…”Also, a very interesting comment of Erwin Schrödinger a 20th century physicist and one of thefounders of quantum physics:“…how can we, from the point of view of statistical physics, reconcile the facts that the gene structure seems toinvolve only a comparatively small number of atoms and that nevertheless it displays a most regular and lawfulactivity with adurability or permanence that borders upon them miraculous?...the evidence that two features, similarin appearance, are based on the same principle, is always precarious as long as the principle itself is unknown.”The present work has focused on one main question: what are the changes in tumor proliferationbefore diagnosis or presentation? To answer this question we have used four axes of investigation. The first was the development of a proliferation model that would simulate tumorgrowth in vitro, right after the onset of tumorigenesis and close to diagnosis, the second was theinvestigation of critical pathways n cell proliferation through the use ofchemotherapeutics/inhibitors, the third was the investigation of gene expression during thestages of proliferation and the fourth was the investigation of changes in extracellularenvironment during proliferation as far as electrochemical and physicochemical properties areconcerned.

Τα νεοπλασματικά νοσήματα έχουν πάρει πλέον τη μορφή επιδημίας. Η αιτιολογία της ογκογένεσηςπαραμένει στο μεγαλύτερο μέρος της άγνωστη. Έχουν διατυπωθεί αρκετές θεωρίες για τουςμηχανισμούς ογκογένεσης αλλά καμία μέχρι σήμερα δεν έχει δώσει μια ικανοποιητική εξήγηση.Ειδικότερα όταν αναφερόμαστε στις παιδικές νεοπλασίες η κατανόηση του φαινομένου λαμβάνει πιοιδιαίτερες διαστάσεις λόγω της ευαισθησίας του πληγμένου πληθυσμού. Η πλειοψηφία των παιδικώννεοπλασιών αφορά στις αιματολογικές κακοήθειες, όπως είναι η Οξεία Λεμφοβλαστική Λευχαιμία(ΟΛΛ). Στην περίπτωση της ΟΛΛ έχει γίνει τεράστια πρόοδος στη θεραπευτική προσέγγισή τηςαφού τα επίπεδα επιβίωσης αγγίζουν το 75%-80%. Το αποτέλεσμα είναι εκπληκτικό αν σκεφθείκανείς ότι 40 έτη πριν η λευχαιμία ήταν θανατηφόρα στο 90% των περιπτώσεων. Παρά την πρόοδοπου έχει επιτευχθεί υπάρχει ακόμα ένα 10-20% των ασθενών, που υποτροπιάζει. Τα αίτια τωνυποτροπών ακόμα δεν έχουν εξηγηθεί ή κατανοηθεί πλήρως.Η περίπτωση του Κεντρικού Νευρικού Συστήματος (ΚΝΣ) είναι αρκετά πιο περίπλοκη. Ταποσοστά επιβίωσης είναι αρκετά χαμηλά και το προσδόκιμο επιβίωσης δεν ξεπερνάει τα δύο με τρίαέτη. Τα νεοπλάσματα του ΚΝΣ έχουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον και βαρύτητα για δύο λόγους. Ο πρώτοςλόγος είναι ότι τα κύτταρα του εγκεφάλου δεν πολλαπλασιάζονται, ή τουλάχιστον δεν επιτελούν αυτήτη διαδικασία στο βαθμό που γίνεται στα υπόλοιπα κύτταρα του σώματος και ο δεύτερος λόγος είναιότι η λειτουργία του εγκεφάλου αποτελεί από μόνη της μια πρόκληση, που ακόμα δεν έχει απαντηθείή κατανοηθεί.Το κύριο βάρος στην έρευνα έχει δοθεί στην κατανόηση των μηχανισμών της ογκογένεσης, τηνταυτοποίηση προγνωστικών παραγόντων και εν γένει την ταξινόμηση και διαφοροποίηση τωννεοπλασιών με τη βοήθεια μοριακών χαρακτηριστικών. Στο σημείο αυτό πρέπει να θυμίσουμε ότι τοκύριο δόγμα της έρευνας ήταν η διατύπωση μιας υπόθεσης και η μετέπειτα διερεύνησή της. Με τηνεμφάνιση των νέων πειραματικών τεχνολογιών, όπως οι μικροσυστοιχίες, η έρευνα άρχισε να κινείταιπρος την κατεύθυνση της διερεύνησης με βάση την ανακάλυψη. Δηλαδή, πρώτα παρατηρούμε καιμετά διερευνούμε. Κατά την προσωπική μας άποψη η παρατήρηση μεγάλου όγκου δεδομένων δεναποκλείει την πρότερη διατύπωση υποθέσεως αλλά αντιθέτως της δίνει και μεγαλύτερη βαρύτητα.Η εφαρμογή αυτών των τεχνολογιών φάνηκε ιδιαίτερα χρήσιμη σε εφαρμογές, όπως η ταυτοποίησητύπων νεοπλασμάτων με καλύτερα αποτελέσματα από τις κλασσικές μεθόδους που μπορούσαν ναεξετάσουν μόνο μερικούς παράγοντες ανά βιολογικό φαινόμενο. Από την άλλη όμως, οι νέεςτεχνολογίες δεν μας βοήθησαν αρκετά στο να κατανοήσουμε το μηχανισμό ασθενειών, όπως οινεοπλασίες, αλλά δημιούργησαν περισσότερα ερωτήματα. Πιθανότατα αυτό να οφείλεται στογεγονός ότι τα βιολογικά φαινόμενα είναι εξαιρετικά περίπλοκα και η κατανόησή τους περνάει μέσααπό άλλες οδούς. Η εφαρμογή των νέων τεχνολογιών στη βιολογία και βιοϊατρική οδήγησε στη δημιουργία μιας νέαςπροσέγγισης στη θεραπευτική που ονομάστηκε ασθενο-κεντρική προσέγγιση. Η προσέγγιση αυτήστοχεύει στο να ανιχνεύσει ειδικούς παράγοντες που διαφοροποιούν, όχι πλέον τη νόσο αλλά τονασθενή. Στο σημείο αυτό πρέπει να αναφέρουμε ότι η παρούσα εργασία κινείται στον αντίθετο άξονααπό την επικρατούσα τάση. Η φιλοσοφία της παρούσης εργασίας αφορά στην κατανόηση τωνβιολογικών φαινομένων και στη διατύπωση γενικών νόμων ή θεωριών που να περιγράφουν ταβιολογικά φαινόμενα. Κατά συνέπεια αν αυτό το προεκτείνουμε στην καρκινική οντογένεση θαλέγαμε, ότι διερευνήσαμε την πιθανότητα ύπαρξης κοινών οδών και μηχανισμών στην καρκινικήβιολογία. Η ιδέα πίσω από τη φιλοσοφία προκύπτει από το γεγονός (και πράγματι αυτό είναι έναγεγονός) ο καρκινικός φαινότυπος είναι παρόμοιος είτε μιλάμε για όγκους του ΚΝΣ είτε του ήπατοςείτε του αίματος. Τέτοια παρόμοια χαρακτηριστικά είναι η μη ελεγχόμενη πολλαπλασιαστικήδυναμική, η απώλεια των μηχανισμών της απόπτωσης, η απώλεια της ιδιότητας της αναστολής λόγωμεμβρανικής αλληλεπίδρασης και άλλα. Αυτή η κοινή μηχανική πιθανότατα να προκύπτει απόκοινούς μοριακούς μηχανισμούς.Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήσαμε τέσσερα εργαλεία. Το πρώτο είναι ο πειραματισμός, τοδεύτερο ήταν η θεωρία συστημάτων, το τρίτο ήταν η χαοτική μηχανική ήτοι τα μη-γραμμικάσυστήματα και το τέταρτο ήταν η φυσική βιολογία. Δεν πιστεύουμε ότι υπάρχει καλύτερος τρόποςνα περιγράψουμε την παρούσα προσέγγιση παρά μέσα από τα λόγια του μαθηματικού του 19ου αιώνα, Henri Poincaré:“…life is a relationship among molecules and not a property of any molecule…”“…Science is built up of facts, as a house is with stones. But a collection of facts is no more a science, than a heapof stones is a house…”Επίσης έχει τεράστιο ενδιαφέρον να παραθέσουμε τα λόγια ενός φυσικού του 20ου αιώνα του ErwinSchrödinger του οποίου οι εργασίες μας επηρέασαν κατά τη μελέτη των παρόντων φαινομένων, “…howcan we, from the point of view of statistical physics, reconcile the facts that the gene structure seems to involve only acomparatively small number of atoms and that nevertheless it displays a most regular and lawful activity withadurability or permanence that borders upon them miraculous?...the evidence that two features, similar inappearance, are based on the same principle, is always precarious as long as the principle itself is unknown.”Για να συνοψίσουμε, η παρούσα εργασία επικεντρώθηκε σε μια βασική ερώτηση: ποιες είναι οιαλλαγές και μηχανισμοί που λαμβάνουν χώρα κατά τον καρκινικό πολλαπλασιασμό πριν τηδιάγνωση; Για να επιχειρήσουμε να δώσουμε μια απάντηση σε αυτό το ερώτημα χρησιμοποιήσαμετέσσερις άξονες διερεύνησης. Ο πρώτος άξονας αφορούσε στη δημιουργία ενός in vitro,πολλαπλασιαστικού μοντέλου με στόχο να εξετάσουμε την πορεία των καρκινικών κυττάρων από τηστιγμή της εμφάνισής τους μέχρι τη στιγμή λίγο πριν τη διάγνωση. Ο δεύτερος άξονας αφορούσεστη διερεύνηση κρίσιμων σηματοδοτικών οδών κατά τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό με τη χρήση αναστολέων και/ή φαρμάκων γνωστών για τη δράση τους. Ο τρίτος άξονας αφορούσε στη γονιδιακήέκφραση και ρύθμιση κατά τα στάδια του πολλαπλασιασμού και τέλος ο τέταρτος άξονας αφορούσεστη διερεύνηση των αλλαγών στο εξωκυττάριο περιβάλλον και ειδικότερα στις αλλαγές στιςφυσικοχημικές/ηλεκτροχημικές ιδιότητες των περιβαλλόντων βιολογικών υγρών.