Καταπόνηση και ευζωία εντατικά εκτρεφόμενων ιχθύων

Abstract

The aim of the present work was to investigate potential fish stress biomarkers. In this sense, different physical and chemical stressors were applied to farmed fish and their response was evaluated by means of DNA fragmentation, gene expression of targeted genes and cortisol quantification, which is considered as the stress hormone. Gilthead seabream Sparus aurata was chosen as the most economically important species of the aquaculture industry in the Mediterranean basin. Genes chosen for quantification were insulin- like growth factors IGF-I and IGF-II, glucocorticoid receptor GcR, glucokinase GK, metallothionein MT, glutathione reductase GR, glutathione peroxidases GPx. Eventually, since the information on GPx genes of seabream was scarce, all four homologues were cloned and characterized de novo. Fish experimental groups were exposed to stress factors such as fasting and confinement. IGF-I and GcR were differentially expressed during fasting period compared to the control. Furthermore, IGF-I and GK genes were differentially expressed during confinement, while GR and GcR were up-regulated in fish post-exposed to the stressor. Relative expression analysis in fish liver demonstrated that GPx1 genes were not regulated by dietary restriction; GPx4b was differentially expressed opposed to regularly fed fish. On the other hand, both GPx1 and GPx4 genes were up-regulated in fish post exposed to confinement, considered as a response to acute stress. Cortisol values were elevated, in response to acute stress, at 1 and 24h after handling. On the other hand, fasting marginally affected plasma cortisol, during the experimental period. DNA fragmentation reached maximum levels during confinement and was substantially reduced during recovery period. GR, Gk, GcR and IGF-I were suppressed and MT was up-regulated, during exposure to waterborne copper and zinc. DNA damage in the liver was mainly associated with heavy metal dosage rather than period of exposure. Finally, zinc induced plasma cortisol in all treatments while copper only for the higher dosage and for the longest period of exposure. Studies on the molecular level of stress response in fish produce valuable data on the molecular mechanisms implicated in fish welfare. Ongoing research should lead to considerable new knowledge, among which is the identification of stress indicators with predictive and diagnostic usefulness.

Στόχος της παρούσας διατριβής ήταν η εξέταση πιθανών δεικτών εκτίμησης του stress σε μοριακό επίπεδο. Για το λόγο αυτό εξετάστηκε η γονιδιακή έκφραση συγκεκριμένων γονιδίων-στόχων, η βλάβη του γενετικού υλικού και τα επίπεδα της κορτιζόλης του πλάσματος, που χρησιμοποιείται ευρέως ως δείκτης stress. Η τσιπούρα επιλέχθηκε ως το είδος με το μεγαλύτερο οικονομικό ενδιαφέρον για τη Μεσογειακή υδατοκαλλιέργεια. Τα γονίδια που επιλέχθηκαν για ποσοτικοποίηση ήταν οι ινσουλινόμορφοι αυξητικοί παράγοντες IGF-I και IGF-II, ο υποδοχέας των κορτικοστεροειδών GcR, η γλυκοκινάση Gk, η μεταλλοθειονίνη MT, η αναγωγάση του γλουταθείου GR και οι υπεροξειδάσες του γλουταθείου GPx. Τέλος, πραγματοποιήθηκε κλωνοποίηση και μοριακός χαρακτηρισμών του αντιοξειδωτικού συστήματος των GPx γονιδίων de novo.Τα ψάρια εκτέθηκαν σε ασιτία και περιορισμό σε απόχη. Στη δεύτερη περίπτωση κάποια δείγματα αφέθηκαν σε ηρεμία και πραγματοποιήθηκαν δειγματοληψίες μετά από 1 και 24 ώρες. Η γονιδιακή έκφραση των IGF-I και GcR γονιδίων μεταβλήθηκε κατά τη διάρκεια της ασιτίας. Επίσης, τα IGF-I και Gk φάνηκαν να επηρεάζονται κατά την παγίδευση, ενώ τα GR και GcR παρουσιάστηκαν να αυξορρυθμίζονται μετά το οξύ stress κατά τη διάρκεια της περιόδου ηρεμίας. Η σχετική γονιδιακή έκφραση κατέδειξε ότι τα GPx1 παράλογα δε επηρεάζονται κατά τη διάρκεια της ασιτίας σε αντίθεση με τα GPx4 παράλογα. Αντιθέτως, όλα τα GPx ομόλογα αυξορρυθμίστηκαν, κατά τη διάρκεια της παγίδευσης, ως απόκριση στο οξύ stress. Οι τιμές της κορτιζόλης του πλάσματος παρουσιάστηκαν αυξημένες μετά την έκθεση σε οξύ stress, ενώ η ασιτία επηρέασε τις τιμές της κορτιζόλης οριακά. Τέλος, ο κερματισμός του DNA παρουσίασε τα υψηλότερα επίπεδα κατά την παγίδευση και μειώθηκε κατά την περίοδο ηρεμίας. Σε αντίθεση με το σωματικό stress, οι χημικοί στρεσσογόνοι παράγοντες, όπως τα βαρέα μέταλλα, δρουν απευθείας στα κύτταρα. Το προφίλ της γονιδιακής έκφρασης στο ήπαρ δεν επηρεάστηκε σημαντικά. H γονιδιακή έκφραση των GR, Gk, GcR και IGF-I φάνηκε να μειώνεται σε αντίθεση με αυτή του MT που παρουσιάστηκε αυξημένη κατά τη διάρκεια της έκθεσης σε χαλκό και ψευδάργυρο. Ο κερματισμός του DNA σχετίζεται περισσότερο με τη συγκέντρωση του βαρέως μετάλλου παρά με το χρόνο έκθεσης. Οι μελέτες σε μοριακό επίπεδο μπορούν να αποδώσουν πολύτιμα στοιχεία για τους μηχανισμούς που εμπλέκονται στην αντίδραση στο stress. H έρευνα σε αυτήν την κατεύθυνση θα αποδώσει στο μέλλον σημαντική γνώση, με ταυτοποίηση βιοδεικτών με προγνωστική και διαγνωστική χρησιμότητα.