Αλληλεπίδραση της συγκαλλιέργειας καρκινικών ηπατοκυττάρων με ομόλογα περιφερικά λεμφοκύτταρα in vitro

Abstract

Background: Many studies have suggested that the immune response may play a crucial role in the progression of hepatocellular carcinoma (HCC). Therefore, our aim was to establish a (i) functional culture of primary human tumor hepatocytes and non-tumor from patients with hepatocellular carcinoma (HCC) and (ii) a co-culture system of HCC and non-HCC hepatocytes with autologous peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) in order to study in vitro cell-to-cell interactions.Methods: Tumor (HCC) and non-tumor (non-HCC) hepatocytes were isolated from the liver resection specimens of 11 patients operated for HCC, while PBMCs were retrieved immediately prior to surgery. Four biopsies were obtained from patients with no liver disease who had surgery for non malignant tumor (normal hepatocytes). Hepatocytes were either cultured alone (monoculture) or co-cultured with PBMCs. Flow cytometry measurements for MHC class II expression, apoptosis, necrosis and viability (7AAD) were performed 24 h, 48 h and 72 h in co-culture and monocultures.Results: HCC and non-HCC hepatocytes exhibited increased MHC-II expression at 48h and 72h in co-culture with PBMCs as compared to monoculture, with MHC II-expressing HCC hepatocytes showing increased viability at 72 h. PBMCs showed increased MHC-II expression (activation) in co-culture with HCC as compared to non-HCC hepatocytes at all time points. Moreover, CD8+ T cells had significantly increased apoptosis and necrosis at 48h in co-culture with HCC hepatocytes as compared to monocultures. Interestingly, MHC-II expression on both HCC and non-HCC hepatocytes in co-culture was positively correlated with the respective activated CD8+ T cells.Conclusions: We have established an in vitro co-culture model to study interactions between autologous PBMCs and primary HCC and non-HCC hepatocytes. This direct interaction leads to increased antigen presenting ability of HCC hepatocytes, activation of PBMCs with a concomitant apoptosis of activated CD8+ T cells. Although, a partially effective immune response against HCC exists, still tumor hepatocytes manage to escape.

Σκοπός/Εισαγωγή.Πολλές μελέτες έχουν προτείνει ότι η ανοσιακή απόκριση παίζει σημαντικό και καθοριστικό ρόλο στην δημιουργία καθώς και στην εξέλιξη του ηπατοκυτταρικού καρκίνου (ΗΚΚ), αλλά υπάρχει έλλειψη κατάλληλων πειραματικών μοντέλων βασισμένων στα ανθρώπινα ηπατοκύτταρα έτσι ώστε να μελετηθούν με επιτυχία οι υποκείμενοι μηχανισμοί. Επομένως, ο στόχος μας ήταν να δημιουργήσουμε (α) ένα λειτουργικό σύστημα καλλιέργειας πρωτοταγών ανθρώπινων ηπατοκυττάρων από ασθενείς με ΗΚΚ και (β) ένα σύστημα συγκαλλιέργειας ανθρώπινων καρκινικών και μη-καρκινικών ηπατοκυττάρων με αυτόλογα μονοπύρηνα κύτταρα του περιφερικού αίματος με σκοπό να μελετήσουμε τις in vitro κυτταρικές αλληλεπιδράσεις τους.Μεθοδολογία.Καρκινικά (όγκος) και μη-καρκινικά (πέριξ του όγκου) ηπατοκύτταρα απομονώθηκαν από ιστοτεμάχια ήπατος τα οποία προέρχονταν από 11 ασθενείς με ΗΚΚ που υποβλήθηκαν σε μερική ηπατεκτομή, με υποκείμενη νόσο, ένω η λήψη του αυτόλογου περιφερικού αίματος πραγματοποιήθηκε πριν την ηπατεκτομή. Επίσης, πραγματοποιήθηκε λήψη 4 βιοψιών και αυτόλογου περιφερικού αίματος, από ασθενείς χωρίς ηπατική νόσο, οι οποίοι χειρουργήθηκαν για καλοήθεις όγκους του ήπατος (φυσιολογικά, υγειή ηπατοκύτταρα). Τα ηπατοκύτταρα είτε καλλιεργήθηκαν μόνα τους (μονοκαλλιέργεια/ομάδα ελέγχου), είτε συγκαλλιεργήθηκαν με τα περιφερικά μονοπύρηνα κύτταρα. Η έκφραση των MHC τάξης II μορίων, της απόπτωσης, της νέκρωσης και της βιωσιμότητας (7-AAD/7-αντινομυκίνη-D) (ηπατοκύτταρα και περιφερικά μονοπύρηνα) πραγματοποιήθηκαν με κυτταρομετρία ροής μετά την απομόνωση, πριν τη συγκαλλιέργεια και 24, 48 και 72 ώρες μετά τη συγκαλλιέργεια και στις μονοκαλλιέργειες. Αποτελέσματα.Τα καρκινικά και μη-καρκινικά ηπατοκύτταρα παρουσίασαν αυξημένη έκφραση των MHC τάξης II μορίων στις 48 και 72 ώρες συγκαλλιέργειας με τα περιφερικά μονοπύρηνα κύτταρα συγκριτικά με τις μονοκαλλιέργειες. Στις 72 ώρες τα καρκινικά ηπατοκύτταρα που έκφραζαν MHC-II είχαν αυξημένη βιωσιμότητα. Τα περιφερικά μονοπύρηνα κύτταρα παρουσίασαν αυξημένη έκφραση MHC-II (ενεργοποίηση) στη συγκαλλιέργεια με τα καρκινικά ηπατοκύτταρα σε σχέση με τις αντίστοιχες μη-καρκινικές συγκαλλιέργειες σε όλες τις χρονικές στιγμές. Τα CD8+ Τ κύτταρα είχαν σημαντικά αυξημένη απόπτωση και νέκρωση στις 48 ώρες συγκαλλιέργειας με τα καρκινικά ηπατοκύτταρα σε σύγκριση με τις μονοκαλλιέργειες. Ενδιαφέρον είχε ότι η έκφραση των MHC-II τόσο στα καρκινικά όσο και στα μη-καρκινικά ηπατοκύτταρα είχε θετική συσχέτιση με τα αντίστοιχα ενεργοποιημένα CD8+MHC-II+ Τ λεμφοκύτταρα.Συμπεράσματα.Δημιουργήσαμε, για πρώτη φορά, ένα in vitro μοντέλο συγκαλλιέργειας μεταξύ των αυτόλογων περιφερικών μονοπύρηνων κυττάρων και των πρωτοταγών καρκινικών και μη-καρκινικών ηπατοκυττάρων. Η άμεση αλληλεπίδραση τους οδηγεί σε αύξηση της αντιγονοπαρουσιαστικής ικανότητας των καρκινικών ηπατοκυττάρων με ταυτόχρονη απόπτωση των ενεργοποιημένων CD8+ Τ κυττάρων. Παρόλο που υπάρχει μερικώς δραστική ανοσιακή απάντηση κατά των καρκινικών ηπατοκυττάρων, αυτά καταφέρνουν να διαφύγουν της ανοσιακής επίθεσης.