Ανάπτυξη μεθόδων ανάλυσης DNA / RNA

Abstract

According to the International Exhibition for cancerous diseases presented by the IARC (International Agency for Research on Cancer), breast cancer is the most common cancer among women, with about 1 million new cases worldwide, while prostate cancer is the second most common diagnosis in men and the fifth most common cancer overall. These data necessitate early diagnosis, prognosis and monitoring response to treatment of these patients. To this respect, the identification/evaluation of new molecular biomarkers for breast and prostate cancer is of importance. Growing evidence suggests that the human Kallikrein-related peptidase family which consists of 15 genes encoding serine proteases- is implicated in carcinogenesis. In particular, these genes are over- or under-expressed in both prostate and breast cancer and may represent potential biomarkers.In this PhD Thesis, the development of a multianalyte ultrasensitive method for the simultaneous determination of mRNAs of a number of genes selected as candidate molecular biomarkers is presented. The selected Kallikrein genes’ panel consists of KLK3, KLK4, KLK5, KLK11, KLK15 PCA3, FOLH1 (PSMA) and HPRT1 as reference gene for normalization. These genes are obtained from human prostate cancer cell lines LNCaP, PC3 and DU145. According to the method, the selected genes are simultaneously amplified by polymerase chain reaction (PCR) in the presence of DNA internal standards to circumvent any variation in the PCR efficiency. Internal standards are sequences equally sized with their respective DNA-targets, using the same primers for amplification, and differ only in an area of 24 different bases located in the middle of their sequence, which allows their subsequent identification. After multiplex amplification, PCR products undergo a process of simultaneous multiple detection on the surface of spectrally encoded microspheres. The microspheres contain two fluorescent dyes in different ratios, resulting in up to 100 different groups. All amplification products are biotinylated and hybridize to complementary oligonucleotide-probes, which in turn hybridize, through specific sequence tags, to the capture probes on the surface of the microspheres. The hybrids are detected by a streptavidin–phycoerythrin conjugate via streptavidin-biotin interaction. Finally, the microspheres are analyzed by flow cytometry using two laser beams. The first laser beam is used for the classification of microspheres into groups, thereby identifying the corresponding gene, while the second laser beam excites the phycoerythrin molecules, whose fluorescence is directly related to target concentration.Furthermore, extensive studies were performed regarding acquisition and processing of the flow cytometer data. Specifically, comparison experiments were designed and performed comparing the results obtained by the instrument software, to the corresponding raw data resulting from fluorescence measurements of the microspheres and phycoerythrin. More specifically, an algorithm was developed that includes the essential steps of statistical analysis of raw fluorescence values and skipping the cytometer software, leads to the classification of the microspheres into groups - depending on the DNA-target - while giving information about the concentration of each analyte from the respective phycoerythrin fluorescence value intensity.Finally, in this PhD thesis, a series of experiments aimed to the development of a chemiluminometric method for analysis of nucleic acids using a digital camera as detector is presented. More specifically, the methods applied for the immobilization of DNA sequences in various solid substrates, their hybridization with biotinylated complementary sequences, as well as the interaction of the hybrids with conjugates of either streptavidin-alkaline phosphatase or streptavidin-horseradish peroxidase are described. The detection of the emitted luminescence of the above enzymes was performed using both conventional instruments, such as a luminometer, and a digital camera and comparison of the results of the two detection modes was followed. Subsequently, studies conducted for the existence of any obstruction in chemiluminescence detection between neighboring wells of the microtiter plate are described. Finally, the application of the developed method to the quantitation of double stranded DNA sequences using the image processing software Image J is presented.

Σύμφωνα με τη Διεθνή Έκθεση για τις καρκινικές νόσους που παρουσιάστηκε από τον IARC (International Agency for Research on Cancer), ο καρκίνος του μαστού αποτελεί την πιο κοινή μορφή καρκίνου μεταξύ των γυναικών, με περίπου ένα εκατομμύριο νέα κρούσματα παγκοσμίως, ενώ ο καρκίνος του προστάτη έρχεται δεύτερος σε συχνότητα διάγνωσης στους άνδρες και είναι η πέμπτη συχνότερη μορφή καρκίνου συνολικά. Αυτά τα δεδομένα καθιστούν αναγκαία την έγκαιρη διάγνωση, πρόγνωση και παρακολούθηση της ανταπόκρισης στη θεραπεία ασθενών με καρκίνο του μαστού και του προστάτη. Για το σκοπό αυτό απαιτείται η ανάπτυξη υπερευαίσθητων μοριακών μεθόδων, που στόχο έχουν την ταυτοποίηση ή/και ποσοτικοποίηση νέων μοριακών δεικτών. Αντικείμενο της παρούσας Διδακτορικής Διατριβής ήταν η ανάπτυξη μεθόδου ταυτόχρονου προσδιορισμού των mRNAs σειράς γονιδίων που σχετίζονται με τον καρκίνο μαστού και προστάτη. Η μέθοδος περιλαμβάνει: (i) ταυτόχρονη ενίσχυση (μέσω πολλαπλής αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης, PCR) των cDNAs των mRNAs επιλεχθέντων γονιδίων και (ii) τον ταυτόχρονο ποσοτικό προσδιορισμό των προϊόντων ενίσχυσης με πολλαπλή δοκιμασία υβριδισμού που λαμβάνει χώρα στην επιφάνεια φασματικά κωδικοποιημένων μικροσφαιριδίων. Τα μικροσφαιρίδια αυτά περιέχουν στο εσωτερικό τους δυο φθορίζουσες χρωστικές σε διάφορες αναλογίες, από όπου προκύπτουν έως και 100 διαφορετικές ομάδες σφαιριδίων. Για την αντιστάθμιση των διακυμάνσεων στην απόδοση της PCR, χρησιμοποιήθηκαν συνθετικά εσωτερικά πρότυπα (IS) DNA, τα οποία διαθέτουν τις ίδιες περιοχές σύνδεσης των εκκινητών με τους αντίστοιχους DNA-στόχους. Τα προϊόντα της PCR (DNA-στόχος και IS) έχουν το ίδιο μέγεθος και διαφέρουν μόνο ως προς μια κεντρική αλληλουχία 24 bp, η οποία καθιστά εφικτή τη διάκρισή τους και τον προσδιορισμό τους μετά την PCR. Τα προϊόντα ενίσχυσης των DNA-στόχων και των εσωτερικών προτύπων είναι βιοτινυλιωμένα και υβριδοποιούνται με συμπληρωματικά ολιγονουκλεοτίδια-ανιχνευτές, τα οποία με τη σειρά τους υβριδοποιούνται με τις συμπληρωματικές αλληλουχίες που φέρουν τα φθορίζοντα μικροσφαιρίδια. Τα προϊόντα υβριδοποίησης ανιχνεύονται με σύζευγμα στρεπταβιδίνης – φυκοερυθρίνης μέσω της αλληλεπίδρασης στρεπταβιδίνης-βιοτίνης. Στη συνέχεια, τα μικροσφαιρίδια αναλύονται με κυτταρομετρία ροής με τη χρήση δύο ακτίνων λέιζερ. Μια ακτίνα λέιζερ χρησιμοποιείται για την κατάταξη των μικροσφαιριδίων σε ομάδες, ταυτοποιώντας έτσι το επιλεγμένο γονίδιο, ενώ μία δεύτερη ακτίνα λέιζερ διεγείρει τα μόρια της φυκοερυθρίνης, της οποίας ο φθορισμός σχετίζεται άμεσα με την συγκέντρωση του προς προσδιορισμό DNA-στόχου.Επιπλέον, πραγματοποιήθηκαν εκτενείς μελέτες όσον αφορά στον τρόπο λήψης και επεξεργασίας αποτελεσμάτων από τον κυτταρομετρητή ροής. Συγκεκριμένα, σχεδιάστηκαν και εκτελέστηκαν πειράματα σύγκρισης των αποτελεσμάτων που εξάγονται από το λογισμικό του οργάνου, σε σχέση με τα αντίστοιχα ανεπεξέργαστα δεδομένα που προκύπτουν από τις μετρήσεις φθορισμού των μικροσφαιριδίων και της φυκοερυθρίνης. Ειδικότερα, αναπτύχθηκε αλγόριθμος που περιλαμβάνει τα απαραίτητα βήματα στατιστικής ανάλυσης των ακατέργαστων τιμών φθορισμού και παρακάμπτοντας το λογισμικό του κυτταρομετρητή, που οδηγεί στην κατάταξη των μικροσφαιριδίων σε ομάδες – ανάλογα με το DNA-στόχο – ενώ παράλληλα δίνει πληροφορία για τη συγκέντρωση κάθε αναλύτη από την αντίστοιχη τιμή έντασης φθορισμού φυκοερυθρίνης.Η παρούσα Διδακτορική Διατριβή ολοκληρώνεται με την παρουσίαση μίας σειράς μελετώνμε στόχο την ανάπτυξη φωταυγειομετρικής μεθόδου για αναλύσεις νουκλεϊκών οξέων με χρήση ψηφιακής φωτογραφικής μηχανής ως ανιχνευτή. Αναλυτικότερα, περιγράφονται οι μέθοδοι που εφαρμόστηκαν για την ακινητοποίηση των αλληλουχιών DNA σε διάφορα στερεά υποστρώματα, την υβριδοποίησή τους με βιοτυνιλιωμένες συμπληρωματικές αλληλουχίες, καθώς και την αλληλεπίδραση των υβριδίων με συζεύγματα στρεπταβιδίνης-αλκαλικής φωσφατάσης ή στρεπταβιδίνης-υπεροξειδάσης χρένου. Η ανίχνευση της εκπεμπόμενης φωταύγειας των παραπάνω ενζύμων, πραγματοποιήθηκε τόσο με χρήση συμβατικών οργάνων, όπως το φωταυγειόμετρο, όσο και με τη χρήση ψηφιακής φωτογραφικής μηχανής και ακολούθησε σύγκριση των αποτελεσμάτων που λήφθηκαν με τους δύο τρόπους ανίχνευσης. Στη συνέχεια, περιγράφονται οι μελέτες που πραγματοποιήθηκαν για την αξιολόγηση της παρεμπόδισης στη μέτρηση χημειοφωταύγειας μεταξύ γειτονικών φρεατίων του πλακιδίου μικροτιτλοδότησης. Τέλος, παρουσιάζεται η εφαρμογή της αναπτυχθείσας μεθόδου στην ανίχνευση προϊόντων PCR, ο ποσοτικός προσδιορισμός των οποίων επετεύχθη με το λογισμικό επεξεργασίας ψηφιακής εικόνας Image J.