Μεταγραφική ρύθμιση των γονιδίων ριβοσωμικών πρωτεϊνών κατά την ερυθροποίηση και τις διαταραχές της

Abstract

Ribosomal protein (RP) biosynthesis is a nutrient and energy demanding cellular process, regulated by transcriptional, translational and post-translational mechanisms. Recent experimental evidence suggests that cell-type and tissue-specific heterogeneity exists in the expression patterns of RP genes, despite stoichiometric compilation of RPs into functional ribosomes. In addition, RP gene haploinsufficiency presents with highly specific phenotypes, despite ubiquitous expression and requirement of RPs across all tissues. In human, heterozygous mutations of RP genes result in specific erythropoietic disorders, such as 5q- syndrome and Diamond-Blackfan anemia (DBA).The scope of the present thesis focused on RP gene regulation and role during terminal erythroid differentiation. The unexplained thus far susceptibility of erythroid progenitor cells to RP gene expression imbalance, prompted us to assess RP gene regulation by the lineage-restricted hematopoietic transcription factors (TFs) GATA1 and PU.1, which are considered master regulators of the erythroid and myeloid-lymphoid transcription programs respectively. Initially, the proximal promoter regions of selected RP genes including RPS19, which is mutated in ~25% of DBA cases, were analyzed for the presence of TF consensus binding motifs. GATA1 and PU.1 binding to RP gene promoter regions was verified in vitro and in vivo using mouse erythroleukemia cells (MEL cells), which abnormally co-express both TFs and serve as a well characterized cellular model of the terminal erythroid differentiation stages. GATA1 and PU.1 bind to the RPS19 proximal promoter region in vivo and their binding is modulated during the course of MEL cell differentiation program in a reverse pattern, reminiscent of their functional cross-antagonism. In addition, several RP genes implicated in human disease were verified as direct GATA1 and PU.1 targets, contrary to other erythroid related TFs. ChIPseq data analysis also demonstrates that several RP genes are enriched as potential GATA1 and PU.1 gene targets in mouse and human erythroid cells, with GATA1 binding showing an association with higher expressed RP genes throughout erythroid terminal differentiation stages in human and mouse. Finally, in the present thesis, the proliferation potential, differentiation capacity and response to apoptotic stimuli of MEL cells engineered to ectopically express RPL35a mRNA was addressed, in order to delineate the possible involvement of RPL35a, the first large subunit RP found mutated in patients with DBA, in the terminal erythroid differentiation program. Overall, the results of the present thesis further support the notion that specific RPs may have unique and variable functions affecting critical cellular processes, apart from their structural role on the ribosome. In addition, the possible implication of critical lineage-specific hematopoietic TFs in the transcriptional regulation of RP genes suggests the need of specific regulatory mechanisms that ensure balanced ribosome biogenesis during erythropoiesis. The latter, may help elucidate the erythroid specificity of RP gene mutations in DBA.

Η βιοσύνθεση των ριβοσωμικών πρωτεϊνών (RPs) είναι μια απαιτητική σε συστατικά και ενέργεια κυτταρική λειτουργία, που συντονίζεται σε μεταγραφικό, μεταφραστικό και μετα-μεταφραστικό επίπεδο. Πρόσφατα δεδομένα καταδεικνύουν αυξημένη ετερογένεια στο πρότυπο έκφρασης των γονιδίων των RPs σε κάθε διαφορετικό κυτταρικό τύπο αλλά και διαφορετικούς ιστούς του ίδιου είδους, παρά τη στοιχειομετρική αναγκαιότητα της συμμετοχής τους στη συναρμολόγηση των ριβοσωμάτων. Επιπλέον, η απλοειδία των γονιδίων RPs εκδηλώνεται παθοφυσιολογικά με εξειδικευμένους κυτταρικούς φαινοτύπους, παρά την ευρεία έκφραση και αναγκαιότητά τους σε όλους τους ιστούς. Συγκεκριμένα, οι ετερόζυγες μεταλλάξεις γονιδίων των RPs στον άνθρωπο οδηγούν στην εκδήλωση διαταραχών της ερυθροποίησης, όπως το σύνδρομο 5q- και το σύνδρομο Diamond-Blackfan (DBA). Στην παρούσα διδακτορική διατριβή διερευνήθηκε η γονιδιακή ρύθμιση των RPs και ο ρόλος συγκεκριμένων RPs, κατά τη διαφοροποίηση της ερυθράς σειράς. Συγκεκριμένα, λόγω της αυξημένης ευαισθησίας των πρόδρομων κυττάρων της ερυθράς σειράς στην απλοειδία των γονιδίων RPs, μελετήθηκε η πιθανή ρύθμισή τους από κρίσιμους αιμοποιητικούς μεταγραφικούς παράγοντες. Αρχικά, ανιχνεύθηκαν στους προαγωγείς επιλεγμένων ριβοσωμικών γονιδίων μοτίβα πρόσδεσης για τους μεταγραφικούς παράγοντες GATA1 και PU.1, οι οποίοι συντονίζοντας ανταγωνιστικά προγράμματα έκφρασης γονιδίων καθορίζουν την ερυθρά ή μυελολεμφική διαφοροποίηση, αντιστοίχως. Ο σχηματισμός μεταγραφικών συμπλόκων επιβεβαιώθηκε in vitro και in vivo στα ερυθρολευχαιμικά κύτταρα MEL, ένα καλά χαρακτηρισμένο μοντέλο για τη μελέτη του προγράμματος της ερυθράς διαφοροποίησης, όπου οι παράγοντες GATA1 και PU.1 συν-εκφράζονται. Η in vivo πρόσδεση των παραγόντων GATA1 και PU.1 στον προαγωγέα του γονιδίου RPS19, που βρίσκεται συχνότερα μεταλλαγμένο σε ασθενείς με DBA, εμφανίζει αντίστροφο προφίλ μεταβολής κατά τη διαφοροποίηση των κυττάρων MEL, το οποίο παραπέμπει στο λειτουργικό τους ανταγωνισμό. Επιπλέον, περισσότερα ορθόλογα ριβοσωμικά γονίδια που έχουν εμπλακεί στην ανθρώπινη παθοφυσιολογία αναγνωρίστηκαν ως άμεσοι στόχοι των μεταγραφικών παραγόντων GATA1 και PU.1, σε αντίθεση με άλλους αιμοποιητικούς παράγοντες που σχετίζονται με πρώιμα ή μετέπειτα στάδια της ερυθράς διαφοροποίησης. Η βιοπληροφορική ανάλυση δεδομένων ChIPseq από διαφορετικά μοντέλα ερυθροποίησης για όλα τα ριβοσωμικά γονίδια, αποκαλύπτει ένα εκτενές και δυναμικό προφίλ πρόσδεσης στους προαγωγείς τους από τους παράγοντες GATA1 και PU.1. Επίσης, η πρόσδεση από τον GATA1 συσχετίζεται θετικά με τα απόλυτα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων των RPs κατά τα επιμέρους διακριτά μορφολογικά στάδια της ερυθράς διαφοροποίησης, στον άνθρωπο και στο ποντίκι. Τέλος, στην παρούσα διδακτορική διατριβή προσεγγίστηκε ο πιθανός ρόλος της ριβοσωμικής πρωτεΐνης RPL35a, η οποία έχει βρεθεί μεταλλαγμένη σε ασθενείς με DBA, σε αποφάσεις που σχετίζονται με το δυναμικό πολλαπλασιασμού, την ικανότητα διαφοροποίησης και της απόκρισης σε αποπτωτικά ερεθίσματα κυττάρων MEL που τροποποιήθηκαν γενετικά, ώστε να εκφράζουν έκτοπα το mRNA της RPL35a. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής, υποστηρίζουν την εμπλοκή συγκεκριμένων RPs σε κρίσιμες κυτταρικές λειτουργίες, εκτός από το δομικό τους ρόλο στο ριβόσωμα. Επιπλέον, η μελέτη της πιθανής ρύθμισης των γονιδίων RPs από αιμοποιητικούς μεταγραφικούς παράγοντες, προτείνει την ύπαρξη συγκεκριμένων ρυθμιστικών μηχανισμών για τη διασφάλιση της ισορροπημένης ριβοσωμικής βιογένεσης κατά την ερυθροποίηση, με πιθανές προεκτάσεις στην ερμηνεία της συγκεκριμένης ιστικής εξειδίκευσης που εκδηλώνεται παθοφυσιολογικά λόγω μεταλλάξεων των γονιδίων των RPs.