Characterization of novel molecular pathways that involve TNF receptor family members

Abstract

The tumor necrosis factor (TNF) and TNF receptor (TNFR) superfamily comprises agroup of secreted or membrane-bound ligands and their receptors, respectively with awide range of functions in apoptosis, bone regeneration and immune system regulation(Locksley et al, 2001). Given the immense interest in the functions of TNF receptorfamily members significant effort was put towards the characterization of the signaltransduction pathways which mediate their pleiotropic effects. This led to the discoveryof a family of signal transduction molecules called TNF receptor- associated factors(TRAFs). TRAFs serve as adapter proteins for a variety of cell surface receptors and areable to both negatively regulate programmed cell death pathways and induce genes thatpromote cell survival. TRAF3, a member of this family, has gone from a poorlyunderstood protein to an important multifunctional regulatory protein within a few years.Nonetheless, there are still several open questions regarding the function and regulationof TRAF3. The possible identification of novel TRAF3 interacting proteins may shedlight into how TRAF3 is recruited to different signaling complexes; yet un-identifiedmolecules may be revealed that control TRAF3 function.Given the essential functions of TRAF3 in different signaling pathways that controlinflammation, antiviral immunity and cell survival and its already established role inhuman health, further mechanistic insights into TRAF3 signaling will go a long waytowards understanding this mysterious TRAF. Unpublished results from Dr Eliopoulos’laboratory have utilized the yeast-two hybrid technique to identify novel TRAF3-interacting proteins. Using TRAF3 as bait and a HeLa cDNA library as prey, Ubc9, thesole E2 enzyme in the sumoylation process has been identified. The aim of this thesis isto validate and characterize in detail the nature of this protein’s interaction with TRAF3.We demonstrate that TRAF3 is SUMOylated in vivo and its sumoylation is dependent onUbc9. Absence of sumoylation leads to stabilization of TRAF3 following CD40 signalingand a delayed induction of the alternative NFκB pathway. Knockdown of Ubc9 leads toreduced affinity of TRAF3 with the CD40 receptor which suggests that TRAF3SUMOylation is important for the formation of TRAF3 complexes.

Λόγω του εκτεταμένου επιστημονικού ενδιαφέροντος για την οικογένεια των TNFυποδοχέων, έχει δοθεί αρκετή σημασία στην περιγραφή των σηματοδοτικών μονοπατιώνπου συμμετέχουν τα μέλη αυτής της οικογένειας. Αυτό οδήγησε στην ανακάλυψη μιαςνέας οικογένειας σηματοδοτικών μορίων που ονομάστηκαν TNF-Receptor-AssociatedFactors (TRAFs). Οι πρωτεΐνες TRAF λειτουργούν ως προσαρμογείς για μια ποικιλίαμεμβρανικών υποδοχέων και μπορούν να ρυθμίσουν τόσο θετικά όσο και αρνητικάμονοπάτια που σχετίζονται με την απόπτωση αλλά και να επάγουν γονίδια που προωθούντην κυτταρική επιβίωση. Η TRAF3, μέλος αυτής της οικογένειας, δεν είχε αρχικάμελετηθεί με διεξοδικό τρόπο αλλά τα τελευταία χρόνια έχει δοθεί τεράστια σημασίαστην ανάλυση των λειτουργιών της στο κύτταρο. Ως αποτέλεσμα, τώρα θεωρείται ως μιαπρωτεΐνη με πολλαπλούς ρυθμιστικούς ρόλους σε μια ποικιλία σηματοδοτικώνμονοπατιών. Παρόλα αυτά, υπάρχουν αρκετά ερωτήματα σχετικά με την ρύθμιση τηςίδιας της TRAF3 από άλλους παράγοντες και την λειτουργία της. Η αναγνώριση νέωνμορίων που αλληλεπιδρούν με την TRAF3 μπορεί να ρίξει φως στον τρόπο με τον οποίοη TRAF3 ¨στρατολογείται¨ στα διάφορα σηματοδοτικά συμπλέγματα καθώς καιπιθανούς τρόπους με τους οποίους ρυθμίζεται η λειτουργία της.Με την τεχνική ‘yeast-2-hybrid’ αναγνωρίστηκε η πρωτεΐνη Ubc9 ως νέος παράγονταςαλληλεπίδρασης με την TRAF3. Η Ubc9 είναι το μοναδικό E2 ένζυμο που έχειαναγνωριστεί μέχρι στιγμής να συμμετέχει στο μονοπάτι της Σουμουλίωσης(SUMOylation), μιας σημαντικής μετα-μετάφραστικής τροποποίησης. Ο σκοπός αυτούτου διδακτορικού ήταν ο χαρακτηρισμός αυτής της αλληλεπίδρασης με λεπτομέρεια.Δείχνουμε ότι η TRAF3 σουμουλιώνεται in vitro και ότι η τροποποίηση αυτή οφείλεταιστην Ubc9. Απουσία της τροποποίησης αυτής από την Ubc9 οδηγεί στην σταθεροποίησητου TRAF3 μετά από διέγερση των κυττάρων με CD40 και καθυστέρηση της έναρξηςτου εναλλακτικού μονοπατιού του NF-κB. Τέλος, ¨κλείσιμο¨ της Ubc9 με την μέθοδοτου siRNA οδηγεί σε μειωμένη αλληλεπίδραση της TRAF3 με τον υποδοχέα του CD40,κάτι που οδηγεί στο συμπέρασμα ότι η συγκεκριμένη μετά-μεταφραστική τροποποίησηείναι σημαντική για το σχηματισμό των σηματοδοτικών συμπλεγμάτων που συμμετέχει ηTRAF3.