In vitro μελέτη της πρωτεΐνης Enhancer of RNA interference 1 της Arabidopsis thaliana

Abstract

ERI1 exonucleases are an important subgroup of 3’ exonucleases that participate and regulate the maturation of 3’ end of coding and non coding RNAs. In eykaryotes it has been proposed an evolutionary relationship between ERI1 functions and siRNA pathways. Study of plant homologues from Arabidopsis thaliana and Nicotiana benthamiana revealed their involvement in maturation of the 3’ end of chloroplastic rRNAs. In order to obtain additional information of the activitiy of plant homologues, a biochemical analysis of the A.thaliana homologue, AtERIL1, was performed. AtERIL1 retains 3’ exonuclease activity with a preference towards small RNA oligonucleotides. With less efficiency it can hydrolyse small DNA oligonucleotides and RNA oligonucleotides having cytosine to the 3’ end. Despite the lack of a conserved nucleic acid binding domain, AtERIL1 has the ability to bind to 5S rRNA precusors, small single stranded and double strounded RNA and DNA oligonucleotides. The binding capacity of AtERIL1 is affected by two lysine residues present before the EXOIII domain in the primary protein sequence. Direct activity towards rRNA precursors was not observed during in vitro experiments. This may be explained by either an indirect effect of ΑtERIL1 to rRNA chloroplastic maturation or by the possibility that AtERIL1 may process rRNA precursors as part of complexes consisting by protein or RNA factors. Furthermore, it was found that AtERIL1 was not able to functionally complement the bacterial homologue RNAse T in vivo. Lastly, based on co-immunoprecipitation experiments certain tRNA species were screened by northern blots for their accumulation and maturation status in N.benthamiana lines that either overexpress or downregulate ERI1 homologue. The results of the current thesis confirm the conservation of biochemical properties of ERI1 subgroup in plants and pave the way for hypotheses around its in vivo activities concerning both the mechanism and the type of substrates that may be processed by AtERIL1 in chloroplasts.

Οι ERI1 εξωνουκλεάσες αποτελούν μία σημαντική ομάδα ρυθμιστικών 3’ εξωνουκλεασών με συμμετοχή στην ωρίμανση του 3’ άκρου κωδικών και μη κωδικών μεταγράφων ενώ στους ευκαρυώτες φαίνεται εξελικτικά να εμπλέκεται στην ρύθμιση των μονοπατιών των siRNAs. Η μελέτη των φυτικών ομολόγων σε φυτά Arabidopsis thaliana και Nicotiana benthamiana έδειξαν εμπλοκή των φυτικών εκπροσώπων της υποομάδας των ERI1 στη ρύθμιση της ωρίμανσης χλωροπλαστιδιακών rRNA. Προκειμένου να αποκτηθούν επιπλέον πληροφορίες σε σχέση με την δράση της έγινε με την παρούσα εργασία μια βιοχημική μελέτη της ομολόγου πρωτεΐνης από την Α.thaliana, AtERIL1. H AtERIL1 διατηρεί την ενεργότητα της 3’ εξωνουκλεάσης με προτίμηση σε μονόκλωνα μικρά RNA. Με μικρότερη προτίμηση υδρολύει μικρά DNA υποστρώματα και μονόκλωνα RNA με κυτοσίνη στο 3’ άκρο τους. Παρά την απουσία κάποιας συντηρημένης περιοχής πρόσδεση σε νουκλεϊκά οξέα, η AtERIL1 διατηρεί την ικανότητα πρόσδεσης σε πρόδρομα 5S rRNA μόρια και μικρά μονόκλωνα και δίκλωνα RNA και DNA ολιγονουκλεοτίδια. Στην ικανότητα πρόσδεσης σημαντικό ρόλο έχουν δύο κατάλοιπα λυσίνης που βρίσκονται πριν από την επικράτεια εξωνουκλεάσης. Η απουσία ανάκτησης υδρολυτικής δράσης σε πρόδρομα rRNA μόρια κατά την εκπόνηση in vitro πειραμάτων αφήνει το ενδεχόμενο έμμεσης επίδρασης στην ωρίμανση των χλωροπλαστιδιακών rRNAs ή την άμεση δράση σε σύμπλοκο με κάποιον άλλο πρωτεϊνικό ή μη παράγοντα. Επιπλέον η ικανότητα της AtERIL1` να συμπληρώνει λειτουργικά βακτηριακές 3’ εξωνουκλεάσες δοκιμάστηκε με αρνητικά αποτελέσματα. Τέλος, η επέκταση του βιολογικού ρόλου της AtERIL1 στην ρύθμιση και άλλων τύπων RNA πέραν τον ριβοσωμικών του χλωροπλάστη επιβεβαιώθηκε με υβριδοποίηση κατά northern, oπερονίων tRNA μεταγράφων που βρέθηκαν να ανοσοκατακρημνίζονται με την AtERIL1, σε σειρές υπερέκφρασης και καταστολής της AtERIL1. Οι παρατηρήσεις που πραγματοποιήθηκαν κατά την διδακτορική διατριβή επιβεβαιώνουν ιδιότητες των ERI1 πρωτεϊνών στις φυτικές ομολόγους ενώ θέτουν πιο στέρεες βάσεις για υποθέσεις γύρω από το μηχανισμό και το εύρος των πιθανών φυσικών τους υποστρωμάτων στους χλωροπλάστες.