Ο ρόλος του μεταγραφικού καταστολέα ERF κατά την ογκογένεση και την επιθηλιομεσενχυματική μετάβαση

Abstract

ERF (Ets-2 Repressor Factor) is a transcriptional repressor that belongs to ETS family and is regulated by RTK/RAS/ERK signalling pathway. ETS family members control important biological processes, including cell proliferation, differentiation, apoptosis, hematopoiesis, angiogenesis and oncogenesis. Respectively, ERF could have such a variety of actions, thinking that Erf gene is ubiquitously expressed in the developing mouse embryo and adult tissues as well as in all cell lines that have been examined. ERF’s ERK-mediated phosphorylation determines its subcellular localization. After mitogenic stimulation ERF is phosphorylated by ERK and exported from the nucleus to the cytoplasm, while in the absence of mitogenic stimulation, ERF is accumulating in the nucleus in a non-phosphorylated state and thus can act as a transcriptional repressor, regulating the expression of a big diversity of genes. Although much is known about Erf regulation and some of its basic functions, such as cell cycle arrest by direct suppression of c-Myc with a Rb-dependent manner, as well as inhibition of ets- and ras- induced transformation and Ewing’s sarcoma in cellular systems, with this work we advanced the ERF study a step further. Specifically, here we examined the ERF function to epithelial-mesenchymal transition (EMT) and mammary oncogenesis, as well as the differentiation of trophoblast stem cells (TSCs) that is a critical process in the formation of placenta. Epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) is a key process in cancer progression and metastasis, requiring cooperation of the epidermal growth factor/Ras with the transform¬ing growth factor-β (TGF-β) signaling pathway in a multistep process. The molecular mecha¬nisms by which Ras signaling contributes to EMT, however, remain elusive to a large extent. We therefore examined the transcriptional repressor Ets2-repressor factor (ERF) for its ability to interfere with TGF-β–induced EMT in mammary epithelial cells (EpH4) expressing oncogenic Ras (EpRas). ERF-overexpressing EpRas cells failed to undergo TGF-β–induced EMT, formed three-dimensional tubular structures in collagen gels, and retained expression of epithelial markers. Transcriptome analysis indicated that TGF-β signaling through Smads was mostly unaffected, and ERF suppressed the TGF-β–induced EMT via Semaphorin-7a repression. Inhibition of Semaphorin-7a in the parental EpRas cells inhibited their ability to undergo TGF-β–induced EMT. Our data suggest that oncogenic Ras may play an additional role in EMT via the ERF, regulating Semaphorin-7a and providing a new interconnection between the Ras- and the TGF-β–signaling pathways. The cause of these findings, it was to start the study of Erf deletion from the mouse mammary glands or the mouse primary mammary epithelial cells (PMECs), thus associating ERF with mammary oncogenesis. However, this study is in progress, so there are still no any safe conclusions.Furthermore, we examined the ERF role in the differentiation of trophoblast stem cells (TSCs) that contribute to the placenta formation, a process in which EMT procedure that we studied initially is very important. Homozygous deletion of the Erf in mice has been shown to block chorionic trophoblast differentiation leading to the failure of chorioallantoic fusion and embryo death. Fibroblast growth factor (FGF) signaling is important for the proper trophoblast stem cell (TSC) differentiation and development of the hemochorial placenta. Lack of Fgf2 promotes TSC differentiation while FGF4 or FGF2 is required for murine TSC maintenance. Employing molecular and cellular approaches we show here that low levels of Fgf2 mRNA can be detected ex vivo in TSC. This expression is repressed via direct interaction of ERF with the Fgf2 transcription unit, is increased in the absence of ERF and is decreased in the presence of an ERF mutation resistant to ERK phosphorylation. Fgf2 inhibition by ERF appears to be necessary for the proper differentiation of the chorionic trophoblast stem cells and may account for the Erf knock out phenotype. Finally, differentiation of ERF overexpressing TSC lines suggests that in addition to Fgf2 mediated effects Erf may have an additional role in the commitment of chorionic trophoblasts towards syncytiotrophoblast.Finally, it was shown that reduced dosage of ERF causes complex craniosynostosis (premature fusion of the cranial sutures) in humans and mice. Features of this newly recognized clinical disorder include multiple-suture synostosis, craniofacial dysmorphism, Chiari malformation and language delay. So within this wider work, here using chromatin immunoprecipitation in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and high-throughput sequencing (ChIP-seq), we find that ERF binds preferentially to elements away from promoters that contain RUNX or AP-1 motifs. This work identifies ERF as a novel regulator of osteogenic stimulation by RAS-ERK signaling, potentially by competing with activating ETS factors in multifactor transcriptional complexes.

Ο ERF (Ets-2 Repressor Factor) είναι μεταγραφικός καταστολέας της οικογένειας των ETS γονιδίων, ο οποίος ρυθμίζεται από το μονοπάτι RTK/RAS/ERK. Τα μέλη της οικογένειας των ETS μεταγραφικών παραγόντων ελέγχουν σημαντικές βιολογικές διαδικασίες, όπως τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση, την απόπτωση, την αιμοποίηση, την αγγειογένεση και την ογκογένεση. Αντίστοιχα λοιπόν και ο ERF θα μπορούσε να έχει ανάλογες ποικίλες δράσεις αφού το Erf γονίδιο εκφράζεται παντού στο αναπτυσσόμενο έμβρυο και σε όλους τους ιστούς στο ενήλικο και τις κυτταρικές σειρές που έχουν εξεταστεί. Η ERK-διαμεσολαβούμενη φωσφωρυλίωση του ERF έχει ως αποτέλεσμα την αλλαγή του υποκυτταρικού εντοπισμού του. Έτσι, η φωσφωρυλιωμένη μορφή του ERF (κάτω από μιτογόνες συνθήκες που η ERK είναι ενεργή) βρίσκεται στο κυτταρόπλασμα, ενώ όταν το Ras/Erk μονοπάτι αναστέλλεται, τότε ο ERF συσσωρεύεται γρήγορα στον πυρήνα, αποφωσφωρυλιώνεται και ασκεί τη δράση του ως μεταγραφικός παράγοντας, ρυθμίζοντας την έκφραση ποικίλων γονιδίων. Έχοντας ήδη πλέον ανακαλυφθεί η ρύθμιση του ERF αλλά και κάποιες βασικές του λειτουργίες, όπως η αναστολή του κυτταρικού κύκλου καταστέλλοντας το c-Myc με έναν Rb-εξαρτώμενο τρόπο, καθώς και η αναστολή του ets και ras επαγώμενου μετασχηματισμού και του σαρκώματος του Ewing’s σε κυτταρικά συστήματα, με την παρούσα διδακτορική διατριβή προχωρήσαμε τη μελέτη του ERF ένα βήμα παραπέρα. Συγκεκριμένα, μελετήθηκε ο ρόλος του ERF στην επιθηλιομεσεγχυματική μετάβαση (ΕΜΤ) και την ογκογένεση στο μαστό, καθώς επίσης και στη διαφοροποίηση των τροφοβλαστικών κυττάρων (TSCs), μία κρίσιμη διαδικασία κατά την πλακουντογένεση. Η επιθηλιομεσεγχυματική μετάβαση (ΕΜΤ) είναι μία καθοριστική διαδικασία στην πρόοδο του καρκίνου και τη μετάσταση, απαιτώντας τη συνεργασία των EGF/Ras και TGFβ σηματοδοτικών μονοπατιών σε πολλαπλά επίπεδα. Παρόλα αυτά, οι μοριακοί μηχανισμοί με τους οποίους η Ras σηματοδότηση συμβάλει στο ΕΜΤ, παραμένουν σε μεγάλο βαθμό άγνωστοι. Ως εκ τούτου, μελετήσαμε το κατά πόσον ο ERF είναι ικανός να παρεμβαίνει στο TGFβ-επαγόμενο ΕΜΤ σε επιθηλιακά κύτταρα μαστού (EpH4) που υπερεκφράζουν το ογκογόνο Ras (EpRas). Τα EpRas κύτταρα που υπερεκφράζουν τον ERF απέτυχαν να οδηγηθούν προς TGFβ-επαγόμενο ΕΜΤ, σχημάτισαν τρισδιάστατες σωληνοειδής δομές μέσα σε γέλη κολλαγόνου, και διατήρησαν την έκφραση επιθηλιακών μαρτύρων. Ανάλυση του μεταγραφήματος έδειξε ότι η TGFβ σηματοδότηση μέσω Smads ήταν κυρίως ανεπηρέαστη και ότι ο ERF ανέστειλε το TGFβ-επαγόμενο ΕΜΤ, μέσω καταστολής του Semaphorin-7a. Η αναστολή του Semaphorin-7a στα πατρικά EpRas κύτταρα ανέστειλε την ικανότητά τους να οδηγηθούν προς TGFβ-επαγόμενο ΕΜΤ. Τα αποτελέσματά μας προτείνουν ότι το ογκογόνο Ras μπορεί να παίζει έναν επιπλέον ρόλο στο ΕΜΤ μέσω του ERF, ρυθμίζοντας το Semaphorin-7a και παρέχοντας μία νέα διασύνδεση μεταξύ των Ras- και TGFβ- σηματοδοτικών μονοπατιών. Αφορμή από αυτά τα ευρήματα, ήταν να ξεκινήσει και η μελέτη απαλοιφής του Erf από το μαστό του ποντικού ή από τα ποντικίσια πρωτογενή μαστικά επιθηλιακά κύτταρα (PMECs), συσχετίζοντάς τον έτσι με την ογκογένεση του μαστού. Η μελέτη αυτή όμως είναι σε εξέλιξη, οπότε δεν υπάρχουν ακόμη κάποια ασφαλή συμπεράσματα. Επιπλέον, ασχοληθήκαμε με το ρόλο του ERF στη διαφοροποίηση των τροφοβλαστικών κυττάρων (TSCs), που συμβαίνει κατά την πλακουντογένεση, μία διαδικασία στην οποία παίζει αρκετά σημαντικό ρόλο το ΕΜΤ φαινόμενο που μελετήθηκε αρχικά παραπάνω. Η ομόζυγη απαλοιφή του Erf στο ποντίκι έχει δείξει παλιότερα ότι παρεμποδίζει τη χοριακή τροφοβλαστική διαφοροποίηση, οδηγώντας σε αποτυχία χοριοαλλαντοειδικής σύντηξης και εμβρυϊκό θάνατο. Η FGF σηματοδότηση είναι σημαντική για την κατάλληλη διαφοροποίηση των τροφοβλαστικών κυττάρων (TSCs) και την ανάπτυξη του αιμοχοριακού πλακούντα. Η απουσία του Fgf2 προάγει τη διαφοροποίηση των TSCs, ενώ ο FGF4 ή FGF2 απαιτούνται για τη διατήρηση των TSCs στα ποντίκια. Με μοριακές και κυτταρικές προσεγγίσεις δείξαμε εδώ ότι χαμηλά επίπεδα Fgf2 mRNA μπορούν να ανιχνευτούν ex vivo στα TSCs. Η έκφραση αυτή αναστέλλεται μέσω άμεσης αλληλεπίδρασης του ERF με την Fgf2 μεταγραφική μονάδα, αυξάνεται απουσία ERF και μειώνεται παρουσία μεταλλαγμένου ERF που είναι ανθεκτικός στη φωσφορυλίωση από την ERK. Η αναστολή του Fgf2 από τον ERF φαίνεται να είναι απαραίτητη για την κατάλληλη διαφοροποίηση των χοριακών τροφοβλαστικών κυττάρων (TSCs) και μπορεί να ευθύνεται για το φαινότυπο του Erf knock out. Τέλος, η διαφοροποίηση των TS κυτταρικών σειρών που υπερεκφράζουν ERF προτείνουν ότι πέραν από τις Fgf2 διαμεσολαβούσες επιρροές, το Erf μπορεί να έχει έναν επιπλέον ρόλο στη δέσμευση των χοριακών τροφοβλαστικών κυττάρων προς συγκυτιοτροφοβλάστες. Τέλος, δείχθηκε ότι μειωμένες δόσεις του ERF προκαλούν σύνθετη κρανιοσυνοστέωση (πρόωρο κλείσιμο κρανιακών ραφών) στον άνθρωπο και το ποντίκι. Χαρακτηριστικά αυτής της νέας αναγνωρισμένης κλινικής διαταραχής περιλαμβάνουν τη συνοστέωση ποικίλων κρανιακών ραφών, τη δυσμορφία κρανίου και προσώπου, τη δυσμορφία Chiari και γλωσσική καθυστέρηση. Στα πλαίσια λοιπόν αυτής της ευρύτερης δουλειάς, εδώ έγιναν πειράματα ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης σε ποντικίσιους εμβρυϊκούς ινοβλάστες (MEFs) και μεγάλης κλίμακας αλληλούχιση (ChIP-seq) και βρήκαμε ότι ο ERF προσδένεται κατά προτίμηση σε γενωμικά στοιχεία μακριά από υποκινητές, που περιλαμβάνουν RUNX και AP1 μοτίβα πρόσδεσης στο DNA. Η δουλειά αυτή ταυτοποιεί τον ERF ως ένα νέο ρυθμιστή της οστεογένεσης που επάγεται από RAS-ERK σηματοδότηση, πιθανώς συναγωνιζόμενος τους ETS παράγοντες ενεργοποίησης στα πολυπαραγοντικά μεταγραφικά συμπλέγματα.