Μελέτη μοριακών μηχανισμών επιβίωσης του παρασίτου Leishamania spp. στα φαγοκύτταρα του τελικού ξενιστή

Abstract

The protozoan parasites of the Leishmania genus survive in the phagolysosomal compartment of the mammalian host macrophages by developing strategies subverting its parasitocidal properties. The present PhD research project aimed to contribute to the exploration of specific features of the biogenesis of Leishmania (L.) donovani bearing phagosomes and the understanding of the molecular mechanisms underlying the parasite’s survival in the phagolysosome. Our study focused on the spatial-temporal distribution of specific molecular markers of phagosome maturation (F-actin, Rab7 and LAMP1) and the phosphoinositides (PIs) PtdIns(4,5)P2, PtdIns(3,4,5)P3 and PI3P. For these studies, we set up an in vitro cellular system using transiently or stably transfected RAW264.7 cells expressing certain PI-binding domains. These cells were infected with transgenic Leishmania-mRFP1 parasites and in parallel with opsonised inert 3 μm latex beads. The analysis was performed by confocal microscopy in fixed samples. Overall, our results demonstrated a time deflection in the presence of the phagosome’s maturation molecular markers and of the PIs on the leishmaniophorous phagosome’s membrane as compared with those bearing beads, suggesting a delay in the biogenesis of the leishmaniophorous phagosome. The observed phenomenon could be due to a) the action of parasite’s molecules in the macrophage’s PIs metabolism, b) the role of the different receptor type involved in the Leishmania phagocytosis as compared to that of opsonised beads or/and c) the role that the size and motility of Leishmania promastigotes could play in the delayed sealing and maturation of the newly formed phagosomes.Additionally, we report data contributing to the molecular/structural and functional characterization of the L. donovani LdMAcP, a member of the histidine acid phosphatase family. Sequence comparison of the LdMAcP orthologs in Leishmania spp revealed strain polymorphism and species specificity for the L. donovani complex. The extracellular orientation of the LdMAcP catalytic domain was confirmed in L. donovani promastigotes, wild type and transgenic (L. donovani-rLdMAcP-mRFP1), as well as in transiently transfected mammalian cells expressing rLdMAcP-His. Furthermore, it is demonstrated that LdMAcP confers tartrate resistant acid ecto-phosphatase activity in live L. donovani promastigotes. Interestingly, the L. donovani-rLdMAcP-mRFP1 promastigotes, showed significantly higher infectivity and virulence indexes than control parasites in the infection of mouse macrophages in vitro, highlighting thereby a role for LdMAcP in the parasite’s virulence. Finally, the presence of LdMAcP epitopes in macrophages infected with L. donovani encourage the investigation of a possible functional relationship between this phosphatase and macrophage molecules which could be LdMAcP candidate substrates / partners.

Τα πρωτόζωα παράσιτα Leishmania spp. επιβιώνουν μέσα στο φαγολυσόσωμα των μακροφάγων του θηλαστικού-ξενιστή έχοντας αναπτύξει μηχανισμούς που ανακόπτουν την παρασιτοκτόνο δράση του. Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκαν συγκεκριμένα χαρακτηριστικά της βιογένεσης του λεϊσμανιοφόρου φαγοσώματος με σκοπό τη διερεύνηση και κατανόηση των μηχανισμών επιβίωσης του παρασίτου εντός αυτού. Συγκεκριμένα, μελετήθηκε η χωροχρονική κατανομή των μοριακών δεικτών ωρίμανσης του φαγοσώματος F-actin, Rab7 και LAMP1 και των φωσφοϊνοσιτιδίων (PIs) PtdIns(4,5)P2, PtdIns(3,4,5)P3 και PI3P σε φαγοσώματα μακροφάγων της κυτταρικής σειράς ποντικού RAW264.7 που περιείχαν προμαστιγωτά παράσιτα Leishmania (L.) donovani στατικής φάσης ή οψονοποιημένα αδρανή σφαιρίδια (3 μm) ως ουδέτερους μάρτυρες. Η ανάλυση έγινε σε μονιμοποιημένα δείγματα μακροφάγων με συνεστιακή μικροσκοπία φθορισμού. Συνολικά, τα αποτελέσματα έδειξαν χρονικές «εκτροπές» στην παρουσία των μοριακών δεικτών και των PIs στη μεμβράνη των λεϊσμανιοφόρων φαγοσωμάτων σε σχέση με αυτά των σφαιριδίων, υποδεικνύοντας μία καθυστέρηση της βιογένεσης του φαγολυσοσώματος ή/ και τροποποίησή του από το παράσιτο. Το γεγονός αυτό πιθανά να οφείλεται α) στη δράση κάποιου/ων παράγοντα/ων του παρασίτου στο μεταβολισμό των PIs του μακροφάγου, β) στον τύπο των υποδοχέων του μακροφάγου που εμπλέκονται στη φαγοκυττάρωση της Leishmania σε σχέση με των μαρτύρων ή/ και γ) στη βραδύτερη ολοκλήρωση της εγκόλπωσης των προμαστιγωτών παρασίτων, εξαιτίας του μεγέθους και της κινητικότητάς τους, η οποία ακολούθως συμβάλλει σε καθυστερημένη «σφράγιση» και ωρίμανση του φαγοσώματος.Παράλληλα, πραγματοποιήθηκε βιοχημικός και λειτουργικός χαρακτηρισμός ενός εν δυνάμει μολυσματικού παράγοντα του παρασίτου L. donovani, της μεμβρανικής όξινης φωσφατάσης ιστιδίνης LdMAcP. Τα αποτελέσματα της in silico ανάλυσης έδειξαν ότι η LdMAcP είναι ειδική για το σύμπλεγμα L. donovani, εντός του οποίου παρουσιάζει πολυμορφισμούς. Σε προμαστιγωτά παράσιτα αγρίου τύπου και διαγονιδιακά (L. donovani-rLdMAcP-mRFP1) αποδείχτηκε ότι η LdMAcP έχει την προβλεπόμενη εντόπιση των μεμβρανικών πρωτεϊνών τύπου Ι, με ενεργότητα όξινης έξω-φωσφατάσης ανθεκτικής στην παρουσία του τρυγικού οξέος και ότι είναι Ν-γλυκοζυλιωμένη. Η εντόπιση και η ενζυμική ενεργότητα της LdMAcP επιβεβαιώθηκε και ως ετερόλογα εκφρασμένη (rLdMAcP-His) σε κύτταρα θηλαστικού (HeLa). Επιπλέον, σε κυτταρικό σύστημα in vitro μόλυνσης βρέθηκε ότι η αύξηση των επιπέδων της ενεργούς LdMAcP συμβάλλει στην αύξηση της μολυσματικότητας/ λοιμογόνου ικανότητας και της επιβίωσης των παρασίτων L. donovani-rLdMAcP-mRFP1 σε σύγκριση με τα παράσιτα που εκφράζουν μόνο τον κενό πλασμιδιακό φορέα. Τέλος, η παρουσία επιτόπων της LdMAcP σε μολυσμένα μακροφάγα με παράσιτα Leishmania ενθαρρύνουν τη διερεύνηση της πιθανής λειτουργικής σχέσης μεταξύ της φωσφατάσης και στοιχείων του μακροφάγου που πιθανά αποτελούν υποψήφια υποστρώματα/ εταίρους της.