Διαλεύκανση της δομής της τρίτης διαμεμβρανικής περιοχής του τύπου 1 υποδοχέα του CRF, καθώς και των αλληλεπιδράσεών του με τον CRF και των αναλόγων του

Abstract

The type 1 receptor (CRF1R) for the corticotropin-releasing factor (CRF) is a family B Gprotein coupled receptor (GPCR), which plays a key role in the maintenance of homeostasisby regulating neural and endocrine functions. Malfunction of CRF/CRF1R systems is relatedwith several diseases such as depression and anxiety. The clinical importance of CRF1R is further supported by that CRF1R-selective non-peptide small-molecule antagonists have been shown to display anxiolytic and antidepressant properties in animal models. As all GPCRs, the CRF1R consists of an extracellular amino-terminal domain (N-domain) and seven α-helical transmembrane domains (TM1-TM7), which are connected extracellularly with three loops (EL1-EL3). The CRF and its related peptides, such as sauvagine, bind to theextracellular regions of CRF1R and activate the receptor. In contrast, small-molecule nonpeptide antagonists have been proposed to interact with the TMs of CRF1R and allosterically antagonize peptide-agonist binding and receptor activation. Recently our laboratory has shown that, similar to other GPCRs, the TMs of CRF1R fold such as to form a water-accessible crevice (binding-site crevice) within the plasma membrane. Amino acids of TMs that contact non-peptide CRF analogues should be on the surface of the binding-site crevice of CRF1R. Moreover, TM residues in family A GPCRs have been shown to participate in networks of interactions that play important role in receptor activation. However the molecular mechanisms underlying CRF1R activation and its antagonism by non-peptide molecules are still elusive.The present study aims to 1) obtain structural information for the TMs of CRF1R,starting from TM3, 2) determine structural changes associated with receptor activation, 3)determine TM residues that interact with non-peptide CRF antagonists and 4) elucidate themolecular mechanisms underlying antagonism of receptor activation by non-peptide CRFantagonists. The TM3 has been selected because its tilted orientation in other GPCRs, relative to membrane, allows its residues to establish key interactions with ligands, other TMs and with G-proteins.To obtain structural information for the TM3 of CRF1R, we identified its residues thatare located on the surface of the binding-site crevice of an inactive ligand-free state (apo-state) of the full-length receptor. To achieve this we mutated, one at a time, the TM3 residues to Cys (engineered Cys) and determined their accessibilities by applying the Substituted Cysteine Accessibility Method (SCAM). Among the twenty-two TM3 residues those at positions (upper half of TM3) 1893.26, 1923.29, 1933.30, 1953.32, 1963.33, 1993.36 and 2033.40 were found to be located on the surface of the binding site crevice. These results suggest that the TM3 of the apo inactive state of CRF1R is positioned such that the upper half of this helix participates in the formation of a large binding site crevice, whereas the other half is tightly packed with the other TMs. These results are in full agreement with those obtained from a crystallization study of a Nterminally truncated inactive non-peptide ligand-bound state of CRF1R which has been published very recently.Among TM3 residues, those at positions 2033.40 and 2103.47 play crucial role in receptoractivation. Mutation of G2103.47 to Cys (G2103.47C) largely decreased the high binding affinity of sauvagine, as well as, its potency to stimulate the accumulation of cAMP in cells expressing the receptor. According to our molecular model, which was constructed based on the crystal structures of the inactive glucagon receptor (GCGR) and CRF1R, the G2103.47 is located one helical turn below M2063.43. The M2063.43 forms a hydrogen bond with N2835.54 of TM5. Mutation of G2103.47 to Cys adds a side chain at position 2103.47 which could form an additional hydrogen bond with the side chain of N2835.54 that further strengthens the TM3-TM5 interface, thus stabilizing the inactive conformation of receptor. These results suggest that movements of TM3 and TM5 that take place during activation of family A GPCRs, might also occur in class B receptors and are hampered by strengthening the TM3-TM5 interactions. This suggestion is further supported by the fact that mutation of G2103.47 to Ala (G2103.47A) did not largely decrease the binding affinity and potency of sauvagine. In contrast to Cys, Ala at 2103.47 position of CRF1R did not form a hydrogen bond with N2835.54, and thus having a much smaller impact on receptor activation. As G2103.47, F2033.40 in TM3 plays an important role in receptor activation. Mutation of F2033.40 to Cys (F2033.40C) largely decreased the ability of receptor to adopt its active state and to bind sauvagine with high affinity. Interestingly, addition of a Lys-like chain to F2033.40C after its reaction with the positively charged reagent, MTSEA, restored sauvagine binding to normal (high affinity) levels. Similarly, addition of a Lys side chain at position 2033.40 by mutating F2033.40 to Lys (F2033.40K) did not significantly alter the high binding affinity of sauvagine. As F2033.40K substitution, mutation of F2033.40 to Trp (F2033.40 W) or Ile (F2033.40 I) did not decrease the high affinity binding and potency of sauvagine. In marked contrast, removing the hydrophobic side chain at position 2033.40 by mutating F2033.40 to Ala (F2033.40 A) reduced the binding affinity and potency of sauvagine. Based on these results and comparing the inactive crystal structure of CRF1R with the inactive and active crystal structures of the family A GPCR, β2 adrenergic receptor (β2AR), we propose that F2033.40 in TM3 and L3236.44 in TM6 of CRF1R, forman aromatic-aliphatic interaction in the inactive state of receptor. As in β2AR, activation ofCRF1R is associated with a repositioning of F2033.40 relative to L3236.44 and towards a nearby aromatic amino acid, which possibly interacts with F2033.40, Trp (F2033.40 W) or Ile (F2033.40 I) but not with Ala (F2033.40 A). Such an aromatic-aromatic interaction most likely stabilizes the high affinity binding active state of CRF1R and it is supported by that F2033.40K mutation did not alter sauvagine binding. Lys (such as K2033.40) has been shown to participate in cation-pi interactions with aromatic residues.Despite the fact that the hydrophilic substitution F2033.40K did not alter the ability ofCRF1R to adopt its active state, this modification abolished the binding of the hydrophobic nonpeptide antagonist, antalarmin to receptor. Similarly, F2033.40A mutation abolished antalarmin binding to CRF1R. In marked contrast, the hydrophobic substitutions F2033.40W and F2033.40I did not decrease the binding and antagonistic properties of antalarmin. These results suggest that F2033.40 interacts with non-peptide CRF antagonists, as also observed in the crystal structure of CRF1R in complex with the non-peptide antagonist CP-376395 . Interaction of non-peptide CRF antagonists with TMs of CRF1R and intercalation between them most likely hampers receptor activation-associated movements of these regions. Conclusively the present study provided structural information for the CRF1R and elucidated the molecular mechanisms underlying receptor activation and its antagonism by small non-peptide molecules. In parallel this study designed, synthesized and pharmacologically evaluated several non-peptide CRF analogues. Among the 50 compounds tested, four showed promising binding affinities for CRF1R and were selected as lead compounds for the design of novel molecules. All the results of the present study will put the basis for the design of novel non-peptide CRF1R-selective antagonists with improved pharmacodynamic and pharmacokinetic properties that will enrich the pharmaceutical armoire against CRF1R-related disorders such as depression and anxiety.

Ο τύπου 1 υποδοχέας (CRF1R) του εκλυτικού παράγοντα της κορτικοτροπίνης (CRF)ανήκει στην οικογένεια Β των υποδοχέων που συζευγνύονται με τις G-πρωτεΐνες (GPCRs) και παίζει σημαντικό ρόλο στη διατήρηση της ομοιόστασης, ρυθμίζοντας νευρικές καιενδοκρινικές λειτουργίες . Δυσλειτουργία των CRF/CRF1R συστημάτων στον οργανισμό, σχετίζεται με την εκδήλωση ασθενειών, όπως το άγχος και η κατάθλιψη. Ο σημαντικός ρόλος του CRF1R ενισχύεται περαιτέρω από το γεγονός ότι CRF1R-εκλεκτικοί μη πεπτιδικοί μικρομοριακοί ανταγωνιστές έχει δειχθεί ότι έχουν αγχολυτικές και αντικαταθλιπτικές δράσεις σε πειραματόζωα. Όπως όλοι οι GPCRs, έτσι και ο CRF1R αποτελείται από μια εξωκυττάριο αμινοτελική Ν-περιοχή και επτά α-ελικοειδείς διαμεμβρανικές περιοχές (ΤΜ1-ΤΜ7), οι οποίες συνδέονται εξωκυττάρια μεταξύ τους με τρεις βρόγχους (EL1-EL3). Ο CRF και τα συγγενή του πεπτίδια, όπως η σοβαγίνη, δεσμεύονται στις εξωκυττάριες περιοχές του CRF1R και τον ενεργοποιούν. Αντίθετα, οι μικρομοριακοί μη πεπτιδικοί CRF ανταγωνιστές έχει προταθεί ότι αλληλεπιδρούν με τις ΤΜs του CRF1R και ανταγωνίζονται αλλοστερικά τη δέσμευση του CRF και των συγγενών του πεπτιδίων-αγωνιστών και την ενεργοποίηση του υποδοχέα .Πρόσφατα, μελέτη του εργαστηρίου μας έδειξε ότι οι ΤΜs του CRF1R, παρόμοια με άλλουςGPCRs, αναδιπλώνονται στο χώρο της πλασματικής μεμβράνης με τέτοιο τρόπο ώστε νασχηματίζουν μια υδρόφιλη κοιλότητα που ονομάζεται κοιλότητα θέσεων δέσμευσης. Τα αμινοξέα των ΤΜs που αλληλεπιδρούν με τα μη πεπτιδικά μόρια θα πρέπει να βρίσκονται πάνω στην επιφάνεια της κοιλότητας θέσεων δέσμευσης του CRF1R. Επιπρόσθετα τα αμινοξέα των ΤΜs των υποδοχέων της οικογένειας Α των GPCRs, έχει δειχθεί ότι συμμετέχουν σε δίκτυα δεσμών που παίζουν σημαντικό ρόλο στην ενεργοποίησή τους . Όμως οι μηχανισμοί ενεργοποίησης του CRF1R και ανταγωνισμού του από τους μικρομοριακούς CRF ανταγωνιστές είναι ακόμα άγνωστοι.Η παρούσα εργασία στοχεύει 1) στη λήψη δομικών πληροφοριών για τις TMs τουCRF1R, ξεκινώντας από τη ΤΜ3, 2) στον προσδιορισμό δομικών αλλαγών που σχετίζονται με την ενεργοποίηση του υποδοχέα, 3) στον προσδιορισμό των αμινοξέων των ΤΜs πουαλληλεπιδρούν με τους μη πεπτιδικούς ανταγωνιστές και 4) διαλεύκανση των μοριακώνμηχανισμών ανταγωνισμού της ενεργοποίησης του υποδοχέα από μη πεπτιδικούς CRFπροσδέτες. Επιλέξαμε την ΤΜ3 γιατί σε πλήθος διαφορετικών υποδοχέων επιτρέπει, λόγω της θέσης της, τη δημιουργία αλληλεπιδράσεων μεταξύ των αμινοξέων της με διάφορουςπροσδέτες, με αμινοξέα άλλων ΤΜs καθώς και με τις G-πρωτεΐνες . Με σκοπό να λάβουμε πληροφορίες για τη δομή της ΤΜ3 του CRF1R, προσδιορίσαμε ποια από τα αμινοξέα της, έχουν τις πλευρικές τους αλυσίδες προσανατολισμένες στην επιφάνεια της κοιλότητας θέσεων δέσμευσης μιας ανενεργού, apo (απουσία προσδέτη) κατάστασης του υποδοχέα. Για να επιτύχουμε αυτό, μεταλλάξαμε, ένα τη φορά, τα αμινοξέα της ΤΜ3 σε κυστεΐνες (τεχνητές κυστεΐνες ή Cys) και προσδιορίσαμε τις διαθεσιμότητες τους, εφαρμόζοντας τη μέθοδο διαθεσιμότητας των κυστεϊνών-υποκαταστατών (SCAM) .Ανάμεσα στα είκοσι δύο αμινοξέα της ΤΜ3 που εξετάστηκαν, εκείνα στις θέσεις (άνω μισότμήμα της TM3) 1893.26, 1923.29, 1933.30, 1953.32, 1963.33, 1993.36 και 2033.40 βρέθηκαν να έχουν τις πλευρικές τους αλυσίδες προσανατολισμένες στην κοιλότητα θέσεων δέσμευσης του CRF1R. Τα αποτελέσματα αυτά οδηγούν στο συμπέρασμα ότι η ΤΜ3 της ανενεργού apo κατάστασης του CRF1R, τοποθετείται με τέτοιο τρόπο στη πλασματική μεμβράνη ώστε το άνω μισό τμήμα της συμμετέχει στο σχηματισμό μιας ευρύχωρης κοιλότητας θέσεων δέσμευσης, ενώ το κατώτερο τμήμα της βρίσκεται σε στενή επαφή με τις άλλες TMs. Τα αποτελέσματα αυτά είναι σε απόλυτη συμφωνία με εκείνα που ελήφθησαν από μια πρόσφατη κρυσταλλογραφική μελέτη μιας ανενεργού, δεσμευμένου με μη πεπτιδικό CRF ανταγωνιστή, κατάστασης του CRF1R.Από τα αμινοξέα της ΤΜ3 που εξετάστηκαν, εκείνα στις θέσεις 2033.40 και 2103.47φάνηκε να παίζουν σημαντικό ρόλο στην ενεργοποίηση του CRF1R. Μετάλλαξη της G2103.47 σε Cys (G2103.47C) μείωσε σημαντικά την υψηλής συγγένειας δέσμευση της σοβαγίνης καθώς επίσης και την ισχύ της να διεγείρει την παραγωγή ενδοκυττάριου cAMP σε κύτταρα που εξέφραζαν τον υποδοχέα αυτό. Σύμφωνα με το μοριακό μας πρότυπο το οποίο κατασκευάστηκε με βάση τις κρυσταλλικές δομές του ανενεργού υποδοχέα της γλυκαγόνης (GCGR) και του CRF1R, η G2103.47 βρίσκεται κάτω από τη Μ2063.43 και σε απόσταση μιας ελικοειδούς στροφής. Η Μ2063.43 σχηματίζει έναν δεσμό υδρογόνου με την Ν2835.54 της ΤΜ5. Η μετάλλαξη της G2103.47 σε Cys εισάγει μια πλευρική αλυσίδα στη θέση 2103.47 που μπορεί να σχηματίσει έναν επιπλέον δεσμό υδρογόνου με την πλευρική αλυσίδα της N2835.54 ο οποίος ενισχύει περαιτέρω την διεπιφάνεια μεταξύ ΤΜ3 και ΤΜ5, σταθεροποιώντας έτσι ακόμη περισσότερο την ανενεργό κατάσταση του υποδοχέα. Τα αποτελέσματα αυτά οδηγούν στην υπόθεση ότι μετατόπιση των ΤΜ3 και ΤΜ5 που παρατηρείται κατά την ενεργοποίηση των υποδοχέων της οικογένειας Α των GPCRs , πιθανόν να συμβαίνει και στους υποδοχείς της οικογένειας Β και να παρεμποδίζεται ενισχύοντας τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των ΤΜ3 και ΤΜ5 αμινοξέων. Η υπόθεση αυτή ενισχύεται περαιτέρω από το γεγονός ότι μετάλλαξη της G2103.47 σε Ala (G2103.47A) επηρέασε πολύ λιγότερο, τόσο τη συγγένεια δέσμευσης, όσο και την ισχύ της σοβαγίνης. Αντίθετα με τη Cys, η Ala στη θέση 2103.47 του CRF1R δεν σχηματίζειδεσμό υδρογόνου με τη N2835.54, επηρεάζοντας έτσι σε πολύ μικρότερο βαθμό τηνενεργοποίηση του υποδοχέα. Παρόμοια με τη G2103.47, η F2033.40 της TM3 φάνηκε να παίζει σημαντικό ρόλο στην ενεργοποίηση του υποδοχέα. Μετάλλαξη της F2033.40 σε Cys (F2033.40C) μείωσε σημαντικά την ικανότητα του υποδοχέα να μεταβαίνει στην ενεργό κατάστασή του και να δεσμεύει με υψηλή συγγένεια τη σοβαγίνη. Αξιοσημείωτο είναι το γεγονός ότι η εισαγωγή πλευρικής αλυσίδας τύπου λυσίνης στον F2033.40C έπειτα από την αντίδρασή του με το θετικά φορτισμένο MTSEA, αποκατέστησε τη δέσμευση της σοβαγίνης σε φυσιολογικά επίπεδα. Παρόμοια, η εισαγωγή της πλευρικής αλυσίδας της Lys στη θέση 2033.40 μετά από τη μετάλλαξη της F2033.40 σε Lys(F2033.40K) δεν τροποποίησε σημαντικά την υψηλής συγγένειας δέσμευση της σοβαγίνης.Όπως παρατηρήθηκε για την F2033.40K, έτσι και η μετάλλαξη της F2033.40 σε Trp (F2033.40 W) ή σε Ile (F2033.40 I) δεν μείωσε την υψηλής συγγένειας δέσμευση και ισχύ της σοβαγίνης.Αντίθετα η αφαίρεση της υδρόφοβης πλευρικής αλυσίδας στη θέση 2033.40 μετά από τημετάλλαξή της σε Ala, μείωσε σημαντικά τη συγγένεια δέσμευσης και ισχύ της σοβαγίνης.Βασιζόμενοι στα αποτελέσματά μας και στη σύγκριση της κρυσταλλικής δομής τουανενεργού CRF1R με τις κρυσταλλικές δομές του ανενεργού και ενεργού β2 αδρενεργικούυποδοχέα (β2AR) που ανήκει στην οικογένεια Α των GPCRs, οδηγούμαστε στο συμπέρασμα ότι η F2033.40 της TM3 και η L3236.44 της TM6 του CRF1R, πιθανόν να σχηματίζουν μια αρωματική- αλειφατική αλληλεπίδραση στην ανενεργό κατάσταση του υποδοχέα. Παρόμοια με τον β2AR, η ενεργοποίηση του CRF1R, σχετίζεται με αλλαγή του προσανατολισμού της F2033.40 σχετικά με τη L3236.44, προς κάποιο γειτονικό αρωματικό αμινοξύ με το οποίο πιθανόν να αλληλεπιδρά.Μια τέτοια αρωματική-αρωματική αλληλεπίδραση πιθανόν να σταθεροποιεί την υψηλήςσυγγένειας δέσμευση της σοβαγίνης της ενεργού κατάστασης του CRF1R. Το γεγονός ότι ηF2033.40K μετάλλαξη δεν τροποποίησε τη δέσμευση της σοβαγίνης ενισχύει περαιτέρω τηνυπόθεση αυτή. Η Lys (όπως η K2033.40) έχει δειχθεί ότι μπορεί να σχηματίζει κατιόν-παλληλεπιδράσεις με αρωματικά αμινοξέα .Παρά το γεγονός ότι η μετάλλαξη της F2033.40 στην υδρόφιλη Lys (F2033.40K) δεν άλλαξε την ικανότητα του CRF1R να μεταβαίνει στην ενεργό του κατάσταση, η τροποποίηση αυτή κατήργησε την δέσμευση του υδρόφοβου μη πεπτιδικού CRF ανταγωνιστή, ανταλαρμίνη στον υποδοχέα αυτόν. Παρόμοια, η μετάλλαξη F2033.40A κατήργησε την ικανότητα του υποδοχέα να δεσμεύει την ανταλαρμίνη. Αντίθετα, οι υδρόφοβες υποκαταστάσεις F2033.40W και F2033.40I δεν μείωσαν τη δέσμευση και τις ανταγωνιστικές ιδιότητες της ανταλαρμίνης. Τα αποτελέσματα αυτά οδηγούν στο συμπέρασμα ότι η F2033.40 αλληλεπιδρά με τους μη πεπτιδικούς CRF ανταγωνιστές, όπως παρατηρήθηκε και στη κρυσταλλική δομή του CRF1R δεσμευμένου με τον μη πεπτιδικό ανταγωνιστή CP-376395 . Η αλληλεπίδραση των μη πεπτιδικών CRF ανταγωνιστών με τις ΤΜs του CRF1R πιθανόν να παρεμποδίζει μετατοπίσεις των περιοχών αυτών που σχετίζονται με την ενεργοποίηση του υποδοχέα. Συμπερασματικά, η παρούσα μελέτη πρόσφερε δομικές πληροφορίες για τον CRF1R και διαλεύκανε τους μοριακούς μηχανισμούς ενεργοποίησης του υποδοχέα και ανταγωνισμού της από τους μη πεπτιδικούς CRF ανταγωνιστές. Επιπρόσθετα στη μελέτη αυτή σχεδιάστηκαν, συντέθησαν και χαρακτηρίστηκαν φαρμακολογικά μη πεπτιδικά ανάλογα του CRF. Ανάμεσαστα 50 ανάλογα που εξετάστηκαν, τέσσερα παρουσίασαν ικανοποιητικές συγγένειεςδέσμευσης για τον CRF1R και επιλέχθηκαν ως ανάλογα «οδηγοί» με βάση τα οποία θασυντεθούν νέα μόρια. Όλα τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης θέτουν τη βάση για τοσχεδιασμό νέων μη πεπτιδικών CRF1R-εκλεκτικών ανταγωνιστών με βελτιωμένεςφαρμακοδυναμικές και φαρμακοκινητικές ιδιότητες που θα εμπλουτίσουν το φαρμακευτικόοπλοστάσιο εναντίον παθήσεων στις οποίες εμπλέκεται ο CRF1R όπως η κατάθλιψη και τοάγχος.