Μελέτη των μονοπατιών των μικρών μορίων RNA στο μεταξοσκώληκα (Bombyx mori): μία in vitro και in vivo προσέγγιση

Abstract

The present PhD Thesis has focused on the study of the small RNA pathways in the silkworm Bombyx mori, highlighting the factors that affect the efficiency of the RNAi mechanism. The factors examined here, mostly, involved the expression of key-genes belonging to the RNA machinery and the presence of a viral infection (persistent or pathogenic), while the mechanisms of the innate immune response and the dsRNA uptake ability from the extracellular medium were also investigated. Analysis of the results yielded important findings and conclusions regarding the impact of the aforementioned factors on the efficiency of silkworm’s RNAi mechanism. Our findings reveal possible overlaps of the main RNAi pathways in the silkworm in vitro, during the gene-silencing process mediated by dsRNA (miRNA, siRNA and piRNA), or hairpin RNA (siRNA and piRNA). Interestingly, except for their implication in the dsRNA-mediated silencing, the genes BmDcr2 and BmAgo2 of the siRNA pathway have proved to operate as key factors in silkworm’ s midgut, both under normal and viral infection (BmCPV) conditions. Additionally, BmAgo3 of the piRNA pathway is an important component affecting the efficiency of the RNAi mechanism in the silkworm, while it can also, together with BmR2D2 and BmTranslin2, and likely BmAub as well, play a crucial role in the antiviral response (BmMLV and AcMNPV) in Lepidoptera. Furthermore, the presence of a persistent infection does not seem to negatively influence the efficiency of the RNAi mechanism (BmMLV) and the antiviral defense (BmCPV) of the silkworm. Finally, the classical pathways of the endogenous innate immunity of B. mori do not respond strongly during antiviral defense (BmCPV) and therefore they do not seem to significantly interact or crosstalk with the RNAi machinery, so as to affect its proficiency. However, the present research highlights new genes that presumably play strategic roles in the antiviral response of the silkworm in combination with the RNAi mechanism.

Η παρούσα Διδακτορική Διατριβή εστιάζει στη μελέτη των μονοπατιών των μικρών μορίων RNA στο μεταξοσκώληκα Bombyx mori, υπό το πρίσμα των παραγόντων που επηρεάζουν την αποδοτικότητα του RNAi μηχανισμού. Οι παράγοντες που εξετάστηκαν αφορούσαν κυρίως στην έκφραση γονιδίων-κλειδιών του RNAi μηχανισμού και στην ύπαρξη ιϊκής μόλυνσης (εμμένουσας ή παθογόνου), ενώ ακόμα έγιναν αναφορές στους μηχανισμούς της ενδογενούς φυσικής ανοσίας και της ικανότητας πρόσληψης dsRNA από το εξωκυττάριο μέσο. Από την ανάλυση των αποτελεσμάτων προέκυψαν σημαντικά συμπεράσματα σχετικά με την επίδραση των προαναφερθέντων παραγόντων στην αποδοτικότητα του μηχανισμού του RNAi στο μεταξοσκώληκα. Τα ευρήματά μας αποκαλύπτουν πιθανή αλληλοεπικάλυψη των βασικών μονοπατιών του RNAi στο μεταξοσκώληκα in vitro, κατά την πρόκληση γονιδιακής αποσιώπησης μέσω dsRNA (miRNA, siRNA και piRNA), ή μέσω φουρκέτας RNA (siRNA και piRNA). Επιπλέον, πέραν της εμπλοκής τους στο μηχανισμό γονιδιακής αποσιώπησης μέσω dsRNA, τα γονίδια BmDcr2 και BmAgo2 του μονοπατιού siRNA αναδεικνύονται ως καίριοι παράγοντες για το μεσέντερο του μεταξοσκώληκα, τόσο υπό φυσιολογικές συνθήκες, όσο και υπό συνθήκες ιϊκής μόλυνσης (BmCPV). Όμως, και το γονίδιο BmAgo3 του piRNA μονοπατιού φαίνεται να συνιστά σημαντικό παράγοντα που επηρεάζει την αποδοτικότητα του RNAi μηχανισμού στο μεταξοσκώληκα, ενώ μπορεί επίσης μαζί με τους παράγοντες BmR2D2 και BmTranslin2, και ενδεχομένως και τον BmAub, να διαδραματίσει κρίσιμο ρόλο για την αντιϊκή απόκριση (BmMLV και AcMNPV) στα Λεπιδόπτερα. Ακόμη, η παρουσία μίας εμμένουσας μόλυνσης δε φαίνεται να επιδρά αρνητικά στην αποδοτικότητα του RNAi μηχανισμού (BmMLV) και στην αντιϊκή προστασία του μεταξοσκώληκα (BmCPV). Τέλος, τα κλασσικά μονοπάτια της ενδογενούς φυσικής ανοσίας του B. mori δεν αποκρίνονται έντονα κατά τη διάρκεια της αντιϊκής προστασίας (BmCPV), και κατά συνέπεια δε φαίνεται να αλληλεπιδρούν σημαντικά με τον RNAi μηχανισμό, ούτως ώστε να επηρεάζουν την αποδοτικότητά του. Ωστόσο, από την παρούσα έρευνα αναδεικνύονται νέα γονίδια που ενδεχομένως διαθέτουν στρατηγικής σημασίας ρόλους για την αντιϊκή απόκριση του μεταξοσκώληκα σε συνδυασμό με τη δράση του RNAi μηχανισμού.