Πυρηνικοί πολυεδρικοί ιοί λεπιδοπτέρων εντόμων: μοριακός χαρακτηρισμός και χρήση σε εφαρμογές βιοτεχνολογίας

Abstract

Nuclear Polyhedrosis Viruses (NPV) belong to the family of Baculoviruses (Baculoviridae), which comprise infectious agents bearing covalently closed circular DNA genomes of 80 – 180 kb and infecting exclusively arthropods of which mostly lepidopteran insects. Baculoviruses infecting the Lepidoptera Bombyx mori and Autographa californica have been studied in depth and are used as models of baculovirus biology and virus-host interactions. Moreover, genetically engineered baculoviruses are widely utilized as biotechnological tools, particularly expression systems for the production of recombinant proteins. Baculovirus Expression Vector Systems (BEVS) have been established and expanded for some decades now, owing to their outstanding capacity for protein production. It must be noted, however, that baculoviruses exhibiting a lytic phase hinder the cellular biosynthetic machinery for post-translational modifications and secretion, leading to a low output of certain types of recombinant protein products. Moreover, the pathology associated with such viruses restricts the production time frame because the cells are eventually killed.The objective of this doctorate thesis was to undertake the genetic manipulation of baculovirus BmNPV (Bombyx mori Nuclear Polyhedrosis Virus), which infects only the silkworm, B. mori, in order to generate a deficient virus capable of infecting silkworm cells and replicating its DNA in them without causing cell pathology and death. These attributes are prerequisites for the construction of a BEVS, which could supersede existing baculovirus-based expression systems by maintaining the capacity for viral DNA replication that would provide adequate numbers of template for efficient transcription of the transgenes of interest, while retaining functional cellular pathways for protein synthesis, modification and secretion. The modified virus was constructed using bacmid technology, which allows the maintenance, replication and engineering of viral genomes in bacteria. It has been based on the elimination of the lef8 gene, an essential gene encoding the catalytic sub-unit of the viral RNA polymerase. Plasmid vectors expressing an amino-terminus Myc-tagged version of the LEF8 protein have also been constructed for the rescue of the deficient bacmid, designated Δlef8, by extra-viral Myc-LEF8 administration. Previous as well as present studies unequivocally have demonstrated that to secure the stability of the deficient virus, the entire open reading frame of lef8 must be removed from the viral genome. Additionally, the rescue expression constructs, providing the LEF8 protein in trans, must express LEF8 through employment of heterologous promoter and poly-adenylation regions. All the above have been necessitated by observations, which suggested that the existence of homologous sequences in the viral genome and rescue vectors invariably leads to the re-introduction of a functional lef8 gene copy inside the viral genome and hence to the loss of the deletion mutation.The deficient bacmid phenotype exhibited all the desired traits, including halting of the viral cycle right after the viral DNA replication step, single-cell infections and the lack of obvious cellular pathology. Despite that however, rescue of the deficient bacmid by extra-viral LEF8 administration was not possible. Further studies showed that the removal of the entire lef8 ORF adversely affected the function of the neighboring essential gene orf40. Homologue lef8 ORFs and recombinant lef8 genes, bearing heterologous promoter and poly-adenylation regions, were introduced into the lef8 genetic locus as replacements of the lef8 ORF, in order to probe for rescue prerequisites. The inserts were used in native or reverse orientation with respect to the orientation of the wild type lef8 ORF. Moreover, recombinant lef8 genes have been inserted as rescue elements in other, unrelated regions of the bacmid genome. Collectively it has been deduced that the provision of promoter elements for the orf40 gene was necessary for Δlef8 rescue, a fact suggesting that important orf40 regulatory sequences must reside inside the 5΄ end of the lef8 ORF, which was removed in Δlef8. Furthermore, it has been established that the expression of both proteins – LEF8 and ORF40 – can be effected by heterologous promoter, with the respective genes being physically unlinked in the viral genome.Given these insights, a new lef8-deficient bacmid was constructed, which employed the cytoplasmic actin promoter of B. mori to direct orf40 expression. The new bacmid could be rescued by transient extra-viral LEF8 administration, without reverting to a pseudo-wild type state by homologous recombination. Thus, Δlef8-infected cells not expressing LEF8 protein remained pathology free, as intended. Advanced rescue systems have already been designed that will increase the efficiency of Δlef8 virus production, leading to higher viral titers. In conclusion, this doctorate thesis proved that the production of a replication competent, non-pathogenic baculovirus that retains its mutant phenotype when propagated by rescue in LEF8-expressing cells is feasible. The new baculovirus vector has the capacity to set the stage for a better baculovirus expression system in comparison to current, lytic virus-based systems. At the same time this work has contributed new knowledge on the salient features of baculovirus genes organization within their genomes and how to exploit them to make better biotechnological systems.

Οι πυρηνικοί πολυεδρικοί ιοί των λεπιδοπτέρων εντόμων ανήκουν στην οικογένεια των βακτροϊών (baculoviruses), οι οποίοι αποτελούν παθογόνους παράγοντες με γονιδίωμα κλειστού κυκλικού δίκλωνου DNA μεγέθους 80-180 kb και προσβάλλουν αποκλειστικά αρθρόποδα και κυρίως λεπιδόπτερα έντομα. Οι βακτροϊοί που προσβάλλουν τα λεπιδόπτερα Bombyx mori και Autographa californica έχουν μελετηθεί σε βάθος και αποτελούν μοντέλα για τη βιολογία της πλειονότητας των βακτροϊών, τις λεπτομέρειες του ιικού κύκλου ζωής και τις επιπτώσεις της μόλυνσης των ξενιστών τους. Επιπλέον, γενετικά τροποποιημένοι βακτροϊοί χρησιμοποιούνται ως βιοτεχνολογικά εργαλεία, κυρίως για παραγωγή ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών. Η χρησιμοποίησή τους για την εφαρμογή αυτή έχει εδραιωθεί εδώ και δεκαετίες, επειδή τα βακτροϊικά συστήματα έκφρασης μπορούν να παράγουν πληθώρα πρωτεϊνών με υψηλή απόδοση. Σημειώνεται όμως ότι οι βακτροϊοί, που διατηρούν μία λυτική φάση στον κύκλο ζωής τους, παρεμποδίζουν τους κυτταρικούς μηχανισμούς μετα-μεταφραστικής τροποποίησης και έκκρισης των πρωτεϊνών, με αποτέλεσμα τα αντίστοιχα συστήματα παραγωγής ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών να παρουσιάζουν μειωμένη απόδοση για συγκεκριμένες κατηγορίες πρωτεϊνών. Επιπλέον, η παθογονικότητα των λυτικών συστημάτων περιορίζει τη χρονική διάρκεια ωφέλιμης λειτουργίας τους λόγω του αναπόφευκτου κυτταρικού θανάτου. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η γενετική τροποποίηση του βακτροϊού BmNPV (Bombyx mori Nuclear Polyhedrosis Virus), που προσβάλει αποκλειστικά το μεταξοσκώληκα (Bombyx mori), με στόχο τη δημιουργία ιού που θα μολύνει κύτταρα-ξενιστές χωρίς να προκαλεί ενεργή παθολογία και θάνατο και θα διατηρεί παράλληλα ακέραια την ικανότητα του να αναπαράγεται. Τα παραπάνω χαρακτηριστικά θα μπορούσαν να αποτελέσουν τη βάση για ένα νέο βακτροϊικό σύστημα έκφρασης που θα πλεονεκτεί έναντι άλλων βακτροϊικών συστημάτων παραγωγής, διότι θα επιτρέπει τη διατήρηση των μηχανισμών σύνθεσης, τροποποίησης και έκκρισης πρωτεϊνών του ξενιστή, ενώ ο ιός θα αντιγράφεται, παρέχοντας υψηλά επίπεδα γονιδιωμάτων, συνεπώς και ανασυνδυασμένων γονιδίων, για αποδοτική έκφραση της επιλεγμένης πρωτεΐνης. Ο τροποποιημένος ιός κατασκευάστηκε με την τεχνολογία βακμιδίου, η οποία επιτρέπει τη διατήρηση, αναπαραγωγή και τροποποίηση του ιικού γονιδιώματος σε βακτήρια. Βασίστηκε στην απομάκρυνση της κωδικής περιοχής ενός σημαντικού γονιδίου, του lef8, που κωδικοποιεί την καταλυτική υπομονάδα της ιικής RNA πολυμεράσης. Στα πλαίσια της δημιουργίας του ελλειμματικού βακμιδίου (βακμίδιο Δlef8) κατασκευάστηκαν πλασμιδιακοί φορείς έκφρασης της φυσικής και αμινοτελικά σημασμένης πρωτεΐνης LEF8 με επίτοπο Myc, οι οποίοι χρησιμοποιήθηκαν για τη διάσωση του ελλειμματικού βακμιδίου μέσω εξωγενούς/ εξωιικής παροχής LEF8. Προηγούμενες εργασίες και επιπλέον δοκιμές στα πλαίσια της παρούσας μελέτης είχαν δείξει ότι για την εξασφάλιση της σταθερότητας του Δlef8 ήταν αναγκαία η αφαίρεση ολόκληρης της κωδικής περιοχής του lef8, καθώς και η χρησιμοποίηση ετερόλογων αλληλουχιών υποκινητή και αλληλουχίας πολυαδενυλίωσης στους φορείς διάσωσης: η διατήρηση ομόλογων περιοχών, ανάμεσα στο γονιδίωμα του ελλειμματικού ιού/βακμιδίου και στους φορείς έκφρασης του γονιδίου lef8 στα κύτταρα-ξενιστές, οδηγούσε σταθερά στην απώλεια της μετάλλαξης με επιστροφή ενός λειτουργικού γονιδίου lef8 στον ιό μέσω ομόλογου ανασυνδυασμού.Ο φαινότυπος του ελλειμματικού βακμιδίου, που δεν μπορούσε να παράγει την πρωτεΐνη LEF8, εμφάνισε τα επιθυμητά χαρακτηριστικά, όπως η διακοπή του κύκλου ζωής του ιού μετά τη φάση αντιγραφής του DNA του και η απουσία εμφανών επιπτώσεων σε διαμολυσμένα κύτταρα-ξενιστές σε ό,τι αφορούσε στη γενικότερη λειτουργικότητα και βιωσιμότητά τους. Όμως, η διάσωση του ελλειμματικού ιού μόνο με εξωγενή χορήγηση της πρωτεΐνης LEF8 δεν ήταν εφικτή. Περαιτέρω μελέτη έδειξε ότι η αφαίρεση της κωδικής περιοχής του lef8 επηρέαζε τη λειτουργία του γειτονικού και επίσης σημαντικού γονιδίου orf40. Κωδικές περιοχές από γονίδια ομόλογα του lef8, καθώς και χιμαιρικά γονίδια lef8, που περιείχαν ετερόλογες αλληλουχίες υποκινητή και αλληλουχίες πολυαδενυλίωσης, εισήχθησαν στο γενετικό τόπο lef8 ως αντικαταστάτες της κωδικής περιοχής του lef8 για τη διερεύνηση των προϋποθέσεων διάσωσης του ελλειμματικού βακμιδίου. Τα ενθέματα δοκιμάστηκαν στη φυσική ή αντίστροφη φορά ενσωμάτωσης σε σχέση με την κατεύθυνση της κωδικής περιοχής του lef8 αγρίου τύπου. Επιπλέον, τα χιμαιρικά γονίδια lef8 δοκιμάστηκαν και σε άλλες, εκτοπικές θέσεις στο βακμιδιακό γονιδίωμα. Συνολικά, διαπιστώθηκε ότι η παροχή αλληλουχιών υποκινητή για το γονίδιο orf40 είναι απαραίτητη για τη διάσωση του ελλειμματικού βακμιδίου, γεγονός που αποδεικνύει ότι σημαντικές αλληλουχίες ρύθμισης της έκφρασης του γονιδίου orf40 βρίσκονται στην κωδική περιοχή του γονιδίου lef8. Επιπλέον, δείχθηκε ότι η έκφραση και των δύο πρωτεϊνών – LEF8 και ORF40 – μπορεί να γίνει αποτελεσματικά από ετερόλογους υποκινητές και ετερόλογες αλληλουχίες πολυαδενυλίωσης και μάλιστα και με τα δύο χιμαιρικά γονίδια σε διαφορετικές, μη συνδεδεμένες θέσεις του ιικού γονιδιώματος. Με βάση τα παραπάνω στοιχεία, κατασκευάστηκε ένα νέο ελλειμματικό βακμίδιο lef8 που χρησιμοποιεί τον υποκινητή του γονιδίου της κυτταροπλασματικής ακτίνης του μεταξοσκώληκα για να ρυθμίζει την ενεργότητα του γονιδίου orf40 και την παραγωγή της πρωτεΐνης ORF40. Το νέο βακμίδιο διασώζεται με εξωγενή χορήγηση της πρωτεΐνης LEF8 σε κύτταρα διάσωσης, που εκφράζουν παροδικά ένα χιμαιρικό γονίδιο lef8. Με αυτό τον τρόπο, δεν παρέχεται στον ελλειμματικό βακτροϊό η δυνατότητα να μεταλλάσσεται στα κύτταρα διάσωσης σε ιό φυσικού τύπου μέσω ομόλογου ανασυνδυασμού. Σε κύτταρα που δεν εκφράζουν την ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη LEF8, ο ελλειμματικός βακτροϊός εμφανίζει τον επιθυμητό μη παθογόνο φαινότυπο για τα κύτταρα-ξενιστές. Έχουν επιπλέον σχεδιαστεί βελτιωμένα συστήματα διάσωσης των ελλειμματικών βακμιδίων, που θα αυξήσουν την απόδοση παραγωγής των ελλειμματικών ιοσωμάτων. Η παρούσα διατριβή έδειξε ότι είναι εφικτή η παραγωγή ενός βακτροϊού μη παθογόνου για κύτταρα-ξενιστές, που διατηρεί την ικανότητα αντιγραφής του γενετικού του υλικού. Επιπλέον, μέσω αυτής της μελέτης επιτεύχθηκε η παραγωγή ελλειμματικών ιοσωμάτων, που διατηρούν τον μεταλλαγμένο φαινότυπο κατά τη διάσωση. Ο νέος βακτροϊικός φορέας έχει τη δυνατότητα να αποτελέσει τη βάση για ένα καλύτερο σύστημα, σε σχέση με τα προϋπάρχοντα βακτροϊικά συστήματα έκφρασης ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών.