Συσχέτιση του βαθμού βλεννογονίτιδας της στοματικής κοιλότητας με κυτταρομορφολογικές αλλοιώσεις και μελέτη της έκφρασης ανοσολογικών δεικτών και δεικτών απόπτωσης σε ασθενείς με κακοήθεις όγκους της κεφαλής και του τραχήλου κατά τη διάρκεια της ακτινοθεραπείας, με ή χωρίς σύγχρονη χημειοθεραπεία

Abstract

BackgroundMucositis is a painful and debilitating side effect of many of thechemotherapy and radiation regimens used to treat head and neck cancerand is associated with significant health and economic costs.Clinical observations suggest that oral mucosal injury results froma series of events in which proinflammatory cytokines, such as TNF andIL-1β, play an important role. Apoptotic cell death is also an importantcomponent of regiment-related mucosal injury. Several studies in animaland human cancer cell lines have described high pro-apoptotic (such asp53) and low anti-apoptotic (such as BCl-2 and MCl-1) proteinexpression.However, apoptotic and pro-inflammatory markers expressed inthe oral mucosa in head and neck cancer patients, who receiveradiotherapy and develop mucositis have not been investigated.Both radiation and chemotherapy are considered to be potentactivators of Nuclear Factor-KappaB (NF-κΒ), a transcription factor thathas been implicated in regulating key elements in the sequence that leadsto oral mucositis. When inactive, NF-κΒ lies dormant in the cytoplasm ofthe cell. Upon stimulation, activated NF-κΒ moves from the cytoplasm to the nucleus, where is capable of upregulating several genes implicated inthe pathophysiology of mucositis.A body of experimental evidence indicates that ionizing radiationinduces biological alterations in irradiated cells. The effects ofradiotherapy on morphology and function of irradiated cells have beenamply studied, but no correlation has been made between clinical (lesionsof mucositis) and cytopathological findings.AimThe aim of the study was to explore the clinical effects ofradiotherapy (grade of mucositis) in relation to the cytologic findings inpatients with head and neck cancer. The expression of pro-apoptoticprotein p53 and anti-apoptotic proteins BCl-2 and MCl-1, as well as theexpression of pro-inflammatory cytokines TNF and IL-1β, within the oralmucosa in patients developing mucositis after receiving radiotherapy forhead and neck cancer was also investigated. Furthermore, the cytoplasmicexpression of NF-κB, before the initiation of radiotherapy, and, at thetime of the highest score of mucositis, was examined.Patients and methodsFifthy-four patients referred from the cancer centers of five Athenshospitals, with malignant head and neck tumor, eligible to receiveradiotherapy, were included in the study. All patients were examined before radiotherapy and cytologicsmears were taken from the oral cavity. During radiotherapy, oralmucositis was recorded and smears were collected on a weekly basis.Some of the specimens were stained with Papanicolaou stain and a fourgrade (G0 to G3) classification system was developed for the evaluationof radiotherapy-induced cell damage. In some additional specimens,immunocytochemical staining was performed by the use of p53, BCl-2,MCl-1, TNF, IL-1β and cytoplasmic NF-κB monoclonal antibodies.ResultsIn 54 of 63 speciments (85.7%), the grade of mucositis matchedthe cytological damage (30 speciments - 47.8%) or differed by just onegrade (24 speciments – 38%).The pro-apoptotic p53 protein was not expressed in the majority ofthe patients before the initiation of radiotherapy, whereas it wasexpressed in the most of them at the time of the highest oral mucositisscore. The expression of anti-apoptotic markers BCl-2 and MCl-1 wasreduced in most patients after radiotherapy. On the contrary, both TNFand IL-1β demonstrated increased expression after radiotherapy, at thetime when the highest mucositis score was recorded. Similar results wereobtained when the five markers were compared within the two groups ofpatients with grade 0 and grade III mucositis. The cytoplasmic NF-κΒ was expressed in the vast majority of thepatients before the initiation of the treatment, whereas, in 78% of thepatients, a reduction of the NF-κΒ levels was recorded at the time of thehighest mucositis score.ConclusionsOur study demonstrated that, in most patients who receiveradiotherapy for head and neck cancer, the grade of mucositis reflects thecytological damage. Our results from the comparison beween clinical andcytological findings support the use of cytology as an objective way toevaluate new preventive and therapeutic methods for patients who receiveRT for head and neck cancer.Oral mucositis in patients receiving radiotherapy for head and neckcancer was associated with an increase in the expression of proinflammatorycytokines TNF and IL-1β, as well as in the expression ofthe pro-apoptotic protein p53 and a decrease in the expression of the antiapoptoticproteins BCl-2 and MCl-1. Our study also demonstrated aninduction of NF-κB activation in patients developing mucositis afterreceiving radiotherapy for head/neck cancer, as it was indicated by thereduction of the transcription factor’s cytoplasmic expression. The resultsof this study point out the crusial role of proinflammatory cytokines, apoptosis and transcription factor NF-κΒ in the pathophysiology of oralmucositis.

ΕισαγωγήΗ βλεννογονίτιδα της στοµατικής κοιλότητας είναι µίαφλεγµονώδης αντίδραση του στοµατικού βλεννογόνου, η οποία αποτελείσυχνή επιπλοκή των σχηµάτων χηµειοθεραπείας και ακτινοθεραπείαςπου χρησιµοποιούνται για τη θεραπεία των κακοήθων όγκων τηςκεφαλής και του τραχήλου. Η βλεννογονίτιδα είναι η οδυνηρότερη και ηπιο εξουθενωτική επιπλοκή της αντικαρκινικής θεραπείας, αλλά και ηεπιπλοκή µε τις µεγαλύτερες συνέπειες για την υγεία του ασθενούς και τοµεγαλύτερο οικονοµικό κόστος για την πολιτεία.Κλινικές παρατηρήσεις υποδεικνύουν ότι η ιστική βλάβη στηβλεννογονίτιδα προκύπτει σαν αποτέλεσµα µίας αλληλουχίας γεγονότωνστα οποία καθοριστικό ρόλο διαδραµατίζουν οι προφλεγµονώδειςκυτταροκίνες όπως ο TNF και η IL-1β. Η κυτταρική απόπτωση αποτελείεπίσης σηµαντική συνιστώσα στην παθοφυσιολογία της βλεννογονίτιδας.Μελέτες σε πειραµατόζωα και κυτταρικές σειρές έχουν περιγράψειυψηλή έκφραση των προαποπτωτικών πρωτεϊνών (όπως το p53) καιχαµηλή των αντιαποπτωτικών, όπως οι BCl-2 και MCl-1.Η έκφραση ωστόσο αποπτωτικών και προφλεγµονωδών δεικτώνδεν έχει µελετηθεί στο στοµατικό βλεννογόνο ασθενών, οι οποίοι αναπτύσσουν βλεννογονίτιδα µετά από τη χορήγηση ακτινοθεραπείας γιακακοήθεις όγκους της κεφαλής κεφαλής και του τραχήλου.Τόσο η ακτινοβολία, όσο και η χηµειοθεραπεία αποτελούνισχυρούς ενεργοποιητές του µεταγραφικού παράγοντα NF-κΒ, ενόςµεταγραφικού παράγοντα που θεωρείται ότι διαδραµατίζει καίριο ρόλοστην αληλουχία των γεγονότων που οδηγούν στην βλεννογονίτιδα τηςστοµατικής κοιλότητας. Ο NF-κΒ στην αδρανή του µορφή βρίσκεται στοκυτταρόπλασµα των κυττάρων, ενώ όταν ενεργοποιηθεί µετακινείταιστον πυρήνα, όπου ενεργοποιεί µία ποικιλία γονιδίων που εµπλέκονταιστην παθοφυσιολογία της βλεννογονίτιδας.Είναι καλά τεκµηριωµένο ότι η ιονίζουσα ακτινοβολία οδηγεί σεβιολογικές µεταβολές του ακτινοβοληµένου κυττάρου. Η επίδραση τηςακτινοθεραπείας στην µορφολογία και λειτουργία των ακτινοβοληµένωνκυττάρων έχει ευρέως µελετηθεί, αλλά ποτέ ως τώρα δεν συσχετίστηκε ηκλινική βλάβη (ακτινοβλεννογονίτιδα) µε τα κυτταροπαθολογικάευρήµατα.ΣκοπόςΟ σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η µελέτη της συσχέτισηςτων διαφόρων κυτταροµορφολογικών αλλοιώσεων που παρατηρούνταικατά την εξέλιξη της βλεννογονίτιδας µε τις αντίστοιχα παρατηρούµενεςσε κλινικό επίπεδο (βαθµός βλεννογονίτιδας) στους ασθενείς που υποβάλλονται σε ακτινοθεραπεία για κακοήθεις όγκους της κεφαλής καιτου τραχήλου. Επίσης διερευνήθηκε η έκφραση της προαποπτωτικήςπρωτεΐνης p53, των αντιαποπτωτικών πρωτεϊνών BCl-2 και MCl-1, αλλάκαι των προφλεγµονωδών κυτταροκινών TNF και IL-1β, στο στοµατικόβλεννογόνο των ασθενών που εµφάνισαν βλεννογονίτιδα µετά από τηχορήγηση ακτινοθεραπείας για κακοήθεις όγκους της κεφαλής και τουτραχήλου. Παράλληλα εξετάστηκε η έκφραση του µεταγραφικούπαράγοντα NF-κΒ πριν από την έναρξη της ακτινοθεραπείας και κατά τηστιγµή του µέγιστου βαθµού βλεννογονίτιδας για κάθε ασθενή.Ασθενείς και µέθοδοιΣτη µελέτη περιελήφθησαν 54 ασθενείς µε κακοήθεις όγκους τηςκεφαλής και του τραχήλου που είχαν προγραµµατιστεί να υποβληθούν σεακτινοθεραπεία. Οι ασθενείς αυτοί παραπέµφησαν για τη φροντίδα τουστόµατός τους στη Μονάδα Οδοντριατρικής ΑντιµετώπισηςΟγκολογικού Ασθενούς της Οδοντιατρικής Σχολής του ΕΚΠΑ από τιςογκολογικές µονάδες πέντε νοσοκοµείων της Αθήνας.Σε όλους τους ασθενείς έγινε στοµατολογική εξέταση και λήψηκυτταρολογικών επιχρισµάτων πριν από την έναρξη τηςακτινοθεραπείας. Κατά τη διάρκεια της ακτινοθεραπείας γινότανεβδοµαδιαία καταγραφή του βαθµού της βλεννογονίτιδας και λήψηκυτταρολογικών επιχρισµάτων. Σε ορισµένα από τα δείγµατα εφαρµόστηκε χρώση κατά Παπανικολάου για τη µελέτη τωνκυτταροµορφολογικών αλλοιώσεων από την ακτινοβόλια καικαθορίστηκε µία κλίµακα τεσσάρων βαθµίδων (G0 έως G3) για τηνεκτίµηση του βαθµού τους. Σε άλλα κυτταρολογικά επιχρίσµαταεφαρµόστηκε ανοσοϊστοχηµεία µε τη χρήση των p53, BCl-2, MCl-1,TNF, IL-1β και κυτταροπλασµατικού NF-κΒ µονοκλωνικώναντισωµάτων.ΑποτελέσµαταΚατά τη µελέτη της συσχέτισης των κυτταροµορφολογιώναλλοιώσεων µε το βαθµό της βλεννογονίτιδας, στο 85.7% των δειγµάτωνυπήρχε ταύτιση (48%) ή απόκλιση µίας µονάχα βαθµίδας (38%), µεταξύτων κλινικών και κυτταρολογικών ευρηµάτων.O προαποπτωτικός δείκτης p53 δεν εκφραζόταν στην πλειοψηφίατων ασθενών πριν από την έναρξη της ακτινοβολίας, ενώ κατά τη στιγµήκαταγραφής του µέγιστου βαθµού βλεννογονίτιδας παρατηρήθηκεέφραση του δείκτη στους περισσότερους ασθενείς. Η έκφραση τωναντιαποπτωτικών δεικτών BCl-2 και MCl-1 µειώθηκε στην πλειοψηφίατων ασθενών µε βλεννογονίτιδα µετά την ακτινοθεραπεία. Αντίθετα, ηέκφραση των προφλεγµονωδών κυτταροκινών TNF και IL-1βκαταγράφηκε αυξηµένη µετά την ακτινοθεραπεία, κατά τη στιγµή τουµέγιστου βαθµού βλεννογονίτιδας. Παρόµοια αποτελέσµατα παρατηρήθηκαν όταν έγινε σύγκριση των πέντε δεικτών µεταξύ δύοοµάδων ασθενών µε βλεννογονίτιδα 0 και ΙΙΙ αντίστοιχα.Ο κυτταροπλασµατικός NF-κΒ ανευρέθηκε να εκφράζεται στηνσυντριπτική πλειοψηφία των ασθενών πριν από την έναρξη τηςακτινοθεραπείας, ενώ η έκφρασή του ελαττώθηκε στο 78% των ασθενώνκατά τη στιγµή της µέγιστης βλεννογονίτδας.ΣυµπεράσµαταΣτη µελέτη διαπιστώθηκε ταύτιση ή µικρή απόκλιση µεταξύ τωνκλινικών και κυτταρολογικών ευρηµάτων στους ασθενείς που ανέπτυξανβλεννογονίτιδα της στοµατικής κοιλότητας µετά από τη χορήγησηακτινοθεραπείας για κακοήθεις όγκους της κεφαλής και του τραχήλου.Τα αποτελέσµατα από τη συσχέτιση των αλλοιώσεων από τηνακτινοβολία σε κυτταρικό και κλινικό επίπεδο, επισηµαίνουν τηχρησιµότητα της κυτταρολογίας σαν µέθοδο αντικειµενικής σύγκρισηςτων διαφόρων προληπτικών και θεραπευτικών παρεµβάσεων στηβλεννογονίτιδα της στοµατικής κοιλότητας.Στη µελέτη παρατηρήθηκε επίσης ότι η βλεννογονίτιδα τηςστοµατικής κοιλότητας στους ασθενείς που υποβάλονται σεακτινοθεραπεία για κακοήθεις όγκους της κεφαλής και του τραχήλου συσχετίζεται µε αύξηση στην έκφραση των προφλεγµονωδώνκυτταροκινών TNF και IL-1β, καθώς και της προαποπτωτικής πρωτεΐνηςp53 και µε ελάττωση στην έκφραση των αντιαποπτωτικών πρωτεϊνώνBCl-2 και MCl-1 µετά την έναρξη της ακτινοθεραπείας. Διαπιστώθηκεακόµη συσχέτιση της βλεννογονίτιδας της στοµατικής κοιλότητας µε τηνεπαγωγή της ενεργοποίησης του µεταγραφικού παράγοντα NF-κΒ, όπωςυποδηλώνεται από την ελάττωση της κυτταροπλασµατικής του έκφρασηςστους ασθενείς που ανέπτυξαν βλεννογονίτιδα. Τα δεδοµένα αυτάαναδεικνύουν τον καίριο ρόλο των προφλεγµονωδών κυτταροκινών, τηςαπόπτωσης και του µεταγραφικού παράγοντα NF-κΒ στηνπαθοφυσιολογία της βλεννογονίτιδας της στοµατικής κοιλότητας.