Ανοσοϊστοχημική μελέτη της αγγειογένεσης και της λεμφαγγειογένεσης στο βασικοκυτταρικό και ανθοκυτταρικό καρκίνωμα του δέρματος των βλεφάρων καθώς και σε προκαρκινωματώδεις δερματικές αλλοιώσεις: συσχέτιση και με κλινικές παραμέτρους

Abstract

The angiogenesis in solid tumors is a process consisting of several stages and regulated byvarious factors and signaling pathways in order to ultimately create a vascular networknecesary for tumor growth. Tumor neovascularization is a prerequisite for the indicatedvolume growth and metastatic potential. In this process, the balance between inhibitors ofangiogenesis, stimulators and inducers is being disturbed. It is proven that the dominant role in this disorder plays the VEGF factor, which has been the subject of extensiveresearch over the last 20 years. Produced by tumor cells and normal stromal, exerts itseffects through its interaction with its receptors, VEGF-R1 (Flt-1) and VEGF-R2 (Flk-1). The emergence of tumor vasculature as an important factor in carcinogenesis, raised theneed for its quantitative measurement. This was made possible by immunohistochemistryand antibodies against activated endothelial cells,such as the CD-105. These proved to bemore specific than their panendothilial indicators used in the past and have established themicrovascular density as an important indicator for biological behavior and clinical outcome in a number of neoplasms.The lymphangiogenesis in tumors is a controversial matter, whether it is a passive processor if it contributes to active lymphatic infestation and spread of tumors. Research associatewith the metastatic ability of some tumors, while other studies failed to showlymphangiogenesis as an indicator assessment of aggressiveness of some cancers. These concerns are further enhanced as there is no such lymphatic marker capable of presenting sensitivity and specificity of the active tumor lymphangiogenesis.The lesions on the skin of the eyelids is a commonly encountered medical condition inclinical practice of the ophthalmologist. The distinction of these lesions is of particularimportance, as they follow different biological behavior. The most commonly found is the basal cell carcinoma, while basosquamous and squamous cell carcinoma and precancerous lesions are rare. The correlation of angiogenesis and lymphangiogenesis has brought upmany works related mainly to malignant melanoma and less to epithelial skin tumors. Noresearch was found to discriminate cutaneous tumors of the eyelids, for which mainlyconcern is the excision of as lesser tissue as possible and also maintaining tissue functionand satisfactory aesthetic result, combined with the complete removal of the tumor.The aim of this research was to study angiogenesis and lymphangiogenesis in basal andsquamous cell carcinomas of the eyelid skin and in precancerous lesions, usingimmunohistochemical techniques. Specifically, particular emphasis was placed onquantitative assessment of expression of the main factors controlling these processes andthe relationship of any predictive value of the results with the clinical outcome of patients.We studied 137 patients with histological preparations belonging to four types of growths.We studied 113 BCC, 6 BSC, 10 SCC and 18 precancerous lesions. In these samples,immunohistochemical staining was performed for the factors VEGF, Flt-1, Flk-1, Flt-4 andCD-105. After their expression was evaluated, we measured microvessel density and aninspection was made of the association of these factors with each other and with clinical parameters such as ulceration, inflammation, sex, age, size and location of the tumors.The study has shown a high rate of overexpression of angiogenic markers in general,followed by a sufficient number of specimens which showed low expression of them. The null expression was a rare event. Specifically VEGF showed strong expression andcorrelated strongly with the receptors Flt-1, Flk-1, Flt-4 and the microvascular density,expressed by the agent CD-105.We found a positive correlation with both intratumoral and peritumoral vascularization. Intensely strong was the association of neovascularization inand around the tumor, suggesting common mechanisms governing the growth potential ofvascular volume and the influence of the factor VEGF. VEGF receptors and particularly the Flk-1, was negatively correlated with the large sized tumors. The study of thosecarcinomas was found to exhibit decreased receptor expression of VEGF, when they reacha critical size and the angiogenic potential became adequate. The factor VEGF has beenshown to be unaffected by the size of the tumor, while as expected, the expression of factorCD-105 correlated with the diameter of tumor, demonstrating the need to achievesufficient neovasculature in order to develop the volume of the growth potential .The comparison of groups of BCC with the more rare BSC, SCC and precancerous lesionsrevealed microvascular density as a marker capable of distinguishing between them. Alarger series of cases of rare tumors, will presumably reinforce the findings of this study.The expression of CD-105 was lower in Bowen's disease and solar keratosis and eventually rising as we move to BCC and more aggressive forms of skin malignancies. No differentiation on the angiogenic potential emerged, when comparing BCC and a subgroup of BCC with multiple tumor appearance. This may be due to either lack of objective differentiation, either in a statistical impossibility, given the small number of cases in thegroup of BCC with multiple appearance. In this study, it was found quite often that CD-105 positive neovascular cells reach as far as the surgical excision boundary of many BCCspecimens. This could be a dissimilarity index of carcinomas in aggressive and non-aggressive and give information about their recurrence tendency. Finally, the strongexpression of angiogenic markers of cutaneous malignancies of the eyelids remains a fact in our study, allowing the possibility that the antiangiogenic therapy could be applied inthe future as a promising therapeutic strategy.

Η αγγειογένεση στους συμπαγείς όγκους είναι μια διαδικασία αποτελούμενη από πολλάστάδια και ρυθμιζόμενη από διάφορους παράγοντες και σηματοδοτικά μονοπάτια μετελικό σκοπό την δημιουργία ενός αγγειακού δικτύου ικανού για την ανάπτυξη του όγκου.Η νεοπλασματική νεοαγγείωση είναι απαραίτητη συνθήκη για να εκδηλώσει ο όγκος τοαυξητικό και μεταστατικό του δυναμικό. Κατά τη διεργασία αυτή, η ισορροπία μεταξύαναστολέων της αγγειογένεσης και διεγερτών της, διαταράσσεται. Κυρίαρχο ρόλο στηδιαταραχή αυτή αποδείχτηκε ότι διαδραματίζει ο παράγοντας VEGF, ο οποίος αποτέλεσεαντικείμενο εκτεταμένων ερευνών τα τελευταία 20 χρόνια. Παράγεται από τανεοπλασματικά κύτταρα και τα φυσιολογικά στρωματικά και ασκεί τη δράση του μέσωτης διασύνδεσής του με τους υποδοχείς VEGF-R1 (Flt-1) και VEGF-R2 (Flk-1). Ηανάδειξη της νεοπλασματικής αγγείωσης ως σημαντικού παράγοντα στην καρκινογένεση,έθεσε την ανάγκη για την ποσοτική της καταμέτρηση. Αυτό κατέστη δυνατό με τηνανοσοϊστοχημεία και τα αντισώματα έναντι ενεργοποιημένων ενδοθηλιακών κυττάρων,όπως το CD-105. Αυτά απεδείχθησαν πιο ειδικά από τους πανενδοθηλιακούς δείκτες πουχρησιμοποιήθηκαν στο παρελθόν και καθιέρωσαν την μικροαγγειακή πυκνότητασημαντικό δείκτη βιολογικής συμπεριφοράς και κλινικής έκβασης σε μια σειράνεοπλασιών.Η λεμφαγγειογένεση στα νεοπλάσματα αποτελεί πεδίο αντιπαράθεσης για το αν είναι μιαδιαδικασία παθητική η αν συμβάλλει στην ενεργό λεμφαγγειακή προσβολή και στηδιασπορά των καρκινωμάτων. Έρευνες την συνδέουν με την μεταστατική ικανότηταορισμένων όγκων, ενώ άλλες μελέτες απέτυχαν να αναδείξουν τη λεμφαγγειογένεση ωςδείκτη εκτίμησης της επιθετικότητας κάποιων νεοπλασιών. Οι παραπάνω προβληματισμοίενισχύονται περαιτέρω καθώς δεν υπάρχει τέτοιος λεμφαγγειακός δείκτης που θα ανάγκη για την ποσοτική της καταμέτρηση. Αυτό κατέστη δυνατό με τηνανοσοϊστοχημεία και τα αντισώματα έναντι ενεργοποιημένων ενδοθηλιακών κυττάρων,όπως το CD-105. Αυτά απεδείχθησαν πιο ειδικά από τους πανενδοθηλιακούς δείκτες πουχρησιμοποιήθηκαν στο παρελθόν και καθιέρωσαν την μικροαγγειακή πυκνότητασημαντικό δείκτη βιολογικής συμπεριφοράς και κλινικής έκβασης σε μια σειράνεοπλασιών.Η λεμφαγγειογένεση στα νεοπλάσματα αποτελεί πεδίο αντιπαράθεσης για το αν είναι μιαδιαδικασία παθητική η αν συμβάλλει στην ενεργό λεμφαγγειακή προσβολή και στηδιασπορά των καρκινωμάτων. Έρευνες την συνδέουν με την μεταστατική ικανότηταορισμένων όγκων, ενώ άλλες μελέτες απέτυχαν να αναδείξουν τη λεμφαγγειογένεση ωςδείκτη εκτίμησης της επιθετικότητας κάποιων νεοπλασιών. Οι παραπάνω προβληματισμοίενισχύονται περαιτέρω καθώς δεν υπάρχει τέτοιος λεμφαγγειακός δείκτης που θα Οι εξεργασίες στο δέρμα των βλεφάρων είναι μια συχνά απαντώμενη πάθηση στηνκλινική πράξη του οφθαλμίατρου. Η διάκριση αυτών των βλαβών είναι ιδιαίτερηςσημασίας, καθώς ακολουθούν διαφορετική βιολογική συμπεριφορά. Οι πλέον συνήθειςαφορούν το βασικοκυτταρικό καρκίνωμα και σπανιότερα το μετατυπικό, τοακανθοκυτταρικό και τις προκαρκινωματώδεις αλλοιώσεις. Η συσχέτιση τηςαγγειογένεσης και της λεμφαγγειογένεσης έχει να αναδείξει πλήθος εργασιών πουαφορούν κυρίως το κακόηθες μελάνωμα και λιγότερο τους επιθηλιακούς δερματικούςόγκους. Δε βρέθηκε να γίνεται διάκριση για τα καρκινώματα του δέρματος των βλεφάρων,για τα οποία κυρίως η αντιμετώπισή τους εμφανίζει ιδιαιτερότητες, όπως η όσο το δυνατόνδιατήρηση λειτουργικού ιστού και η επίτευξη ικανοποιητικού αισθητικού αποτελέσματος,σε συνδυασμό με την πλήρη αφαίρεση του όγκου.Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη της αγγειογένεσης και της λεμφαγγειογένεσης στα βασικοκυτταρικά και ακανθοκυτταρικά καρκινώματα τουδέρματος των βλεφάρων καθώς και στις προκαρκινικές αλλοιώσεις αυτών, με τη χρήσηανοσοϊστοχημικών τεχνικών. Συγκεκριμένα, ιδιαίτερη έμφαση δόθηκε στην ποσοτικήαξιολόγηση της έκφρασης των κύριων παραγόντων ελέγχου των παραπάνω διεργασιώνκαι στη συσχέτιση της τυχόν προγνωστικής αξίας των αποτελεσμάτων με την κλινικήέκβαση των ασθενών.Μελετήθηκαν συνολικά 137 ασθενείς με ιστολογικά παρασκευάσματα που ανήκαν σε 4τύπους νεοπλασιών. Συγκεκριμένα μελετήθηκαν 113 βασικοκυτταρικά, 6 βασικοπλακώδη,10 ακανθοκυτταρικά και 18 προκαρκινικές αλλοιώσεις. Στα δείγματα αυτάπραγματοποιήθηκε ανοσοϊστοχημική χρώση για τους παράγοντες VEGF, Flt-1, Flk-1, Flt-4 και CD-105. Αξιολογήθηκε η έκφρασή τους, μετρήθηκε η μικροαγγειακή πυκνότητα και έγινε έλεγχος της συσχέτισης των παραγόντων αυτών μεταξύ τους αλλά και με κλινικές παραμέτρους όπως η εξέλκωση, η φλεγμονή, το φύλο, η ηλικία, το μέγεθος και η εντόπισητων όγκων.Από τη μελέτη προέκυψε ένα υψηλό ποσοστό υπερέκφρασης των αγγειογενετικώνδεικτών γενικότερα, ακολουθούμενο από έναν ικανό αριθμό περιστατικών τα οποίαεμφάνισαν χαμηλή έκφραση αυτών. Η μηδενική έκφραση αποτέλεσε ένα σπάνιο γεγονός.Συγκεκριμένα ο VEGF εμφάνισε ισχυρή έκφραση και συσχετίστηκε έντονα με τουςυποδοχείς του Flt-1, Flk-1, Flt-4 και με την μικροαγγειακή πυκνότητα, εκφραζόμενη απότον παράγοντα CD-105. Βρέθηκε θετική συσχέτιση τόσο με την ενδο-ογκική όσο και μετην περι-ογκική νεοπλασματική αγγείωση. Επιπλέον ισχυρά σχετίστηκαν μεταξύ τους ηεντός και πέριξ του όγκου νεοαγγείωση, δείχνοντας τους κοινούς μηχανισμούς πουδιέπουν την αύξηση του αγγειακού δυναμικού του όγκου και την επιρροή του από τονπαράγοντα VEGF. Οι υποδοχείς VEGF και κυρίως ο Flk-1, σχετίστηκαν αρνητικά με το μεγάλο μέγεθος των όγκων. Τα προς μελέτη καρκινώματα βρέθηκε να εμφανίζουνμειωμένη έκφραση υποδοχέων VEGF, όταν φτάσουν ένα κρίσιμο μέγεθος και όταν τοαγγειογενετικό τους δυναμικό γίνει επαρκές. Ο παράγοντας VEGF έδειξε να μηνεπηρεάζεται από το μέγεθος του όγκου, ενώ, όπως ήταν αναμενόμενο, η έκφραση τουπαράγοντα CD-105 συσχετίστηκε θετικά με τη διάμετρο των καρκινωμάτων,φανερώνοντας την ανάγκη επίτευξης ικανού νεοαγγειακού δικτύου προκειμένου ο όγκοςνα αναπτύξει το αυξητικό του δυναμικό.Η σύγκριση των ομάδων των βασικοκυτταρικών καρκινωμάτων με τα μετατυπικά, ταπλακώδη και τις προκαρκινικές αλλοιώσεις ανέδειξε την μικροαγγειακή πυκνότητα ωςικανό δείκτη διάκρισης μεταξύ τους. Μια σειρά με περισσότερα περιστατικά από τιςσπανιότερες νεοπλασίες, πιθανώς να ενισχύσει τα ευρήματα της παρούσας μελέτης. Ηέκφραση του CD-105 βρέθηκε χαμηλότερη στη νόσο Bowen και την ακτινική κεράτωση και με αυξητική τάση όσο προχωρούμε προς τα ΒΚΚ και τις επιθετικότερες μορφές των και με αυξητική τάση όσο προχωρούμε προς τα ΒΚΚ και τις επιθετικότερες μορφές των δερματικών κακοηθειών. Ουδεμία διαφοροποίηση προέκυψε κατά τη σύγκριση των ΒΚΚμε μια υποομάδα ΒΚΚ με πολλαπλή εμφάνιση του όγκου όσον αφορά το αγγειογενετικότους δυναμικό. Αυτό μπορεί να οφείλεται είτε σε αντικειμενική απουσία διαφοροποίησης,είτε σε στατιστική αδυναμία δεδομένου του μικρού αριθμού των περιστατικών στην ομάδατων ΒΚΚ πολλαπλής εμφάνισης. Στην παρούσα μελέτη διαπιστώθηκε αρκετά συχνά ταCD-105 θετικά νεοαγγεία να φτάνουν ως το χειρουργικό όριο εκτομής των ΒΚΚ. Αυτό θαμπορούσε να αποτελέσει ένα δείκτη διαφοροποίησης των καρκινωμάτων σε επιθετικά ημη και να δώσει πληροφορίες σχετικά με την τάση τους για υποτροπή. Τέλος, η ισχυρήέκφραση των αγγειογενετικών δεικτών από τις δερματικές κακοήθειες των βλεφάρων,καθιστά δυνατή την πιθανότητα η αντιαγγειογενετική θεραπεία να εφαρμοσθεί στο μέλλονως μια υποσχόμενη θεραπευτική στρατηγική.