Ο ρόλος της HSP70 στην Anoikis (άνευ οίκου) απόπτωση των ενδοθηλιακών κυττάρων

Abstract

HSP70 is one of the most popular and well studied molecular chaperones. I participates in cell survival and in many other cellular pathways. In bibliography, HSP70 has been associated with mechanisms underlying cancer and cardiovascular diseases.In this study we aim to investigate the role of HSP70 in Anoikis apoptosis and in mesenchymal transition of endothelial and cancer cells.Our primary experiments were conducted using HMEC1 endothelial cells. The heat shock response of the cells was investigated and the most appropriate method for inducing exogenous DNA was confirmed to be electroporation. pcDNA3-siRNA-HSP70, a plasmid for HSP70 silencing was constructed. The attempt to produce a stable cell line of HMEC1-siRNA-Hsp70 was unsuccessful, as the cells did not survive. We managed to characterize the phonotypical changes of HMEC1 cells who did not express HSP70 and we resulted that they acquired a mesenchymal phenotype (spindle-like shape, loss of cell-cell contact, multilayer proliferation), accompanied with loss of endothelial cadherin and expression of mesenchymal vimentin.In the next part of this study, we investigated the role of HSP70 in some crucial for the progression of cancer steps and we found that HSP70 do not affect the proliferation rate of HeLa cells. The absence of HSP70 increases the motility and metastasis of cells. Under stress conditions, as elevated temperature, toxic substances and loss of ECM anchorage, HSP70 provides resistance to cell death. Chemοtherapy drugs, Doxorubicin and cis-platin increase the motility and migration of cells, implicating EMT process.Moreover we proposed a model for the role of b-catenin and p53 in Anoikis apoptosis according to which, under the loss of ECM anchorage and cell-cell- adhesion, b-catenin is released from the cell-cell association complexes in the cytoplasm, where activates p53. The posphorylated p53 (active) translocates in the nucleus where it induces the transcription of cell death genes. The activation of these genes results in the activation of caspases and the degradation of b-catenin.Finally, the eterogenicity of cancer cells in the expression of epithelial and mesenchymal markers was confirmed and the induction of EMT in the absence of HSP70, in a WNT independent way was proved.

Η HSP70 αποτελεί έναν από τους δημοφιλέστερους μοριακούς συνοδούς. Διαδραματίζει σημαντικό ρόλο την επιβίωση του κυττάρου δεδομένου ότι εμπλέκεται άμεσα ή έμμεσα σε πολλά βασικά κυτταρικά μονοπάτια. Στη βιβλιογραφία έχει σχετιστεί με κυτταρικούς μηχανισμούς που εμπλέκονται σε ασθένειες, όπως είναι ο καρκίνος και διάφορα καρδιαγγειακά νοσήματα, όπου εκφράζεται σε πολύ υψηλά ποσοστά.Στην παρούσα εργασία ο κύριος στόχος ήταν η διερεύνηση του ρόλου της HSP70 στην Anoikis απόπτωση καθώς και στην επαγωγή μεσεγχυματικής μετάπτωσης σε ενδοθηλιακά και καρκινικά κύτταρα.Τα αρχικά μας πειράματα πραγματοποιήθηκαν στα ενδοθηλιακά κύτταρα HMEC1, όπου μελετήθηκε η απόκριση των κυττάρων στο θερμικό σοκ και καθορίστηκε η καταλληλότερη τεχνική διαμόλυνσης των κυττάρων με εξωγενές DNA. Εν συνεχεία κατασκευάστηκε το πλασμίδιο pcDNA3-siRNA-HSP70, το οποίο φέρει ειδικά επιλεγμένο ένθεμα για την έκφραση siRNA, για τη γονιδιακή αποσιώπηση της HSP70. Πραγματοποιήθηκε απόπειρα δημιουργίας σταθερής κυτταρικής σειράς κυττάρων HMEC1 με γονιδιακή αποσιώπηση της HSP70, τα κύτταρα όμως δεν επιβίωσαν. Σε καλλιέργεια μαζικών κλώνων μελετήθηκαν οι φαινοτυπικές μεταβολές που συνοδεύουν τα κύτταρα HMEC1 με αποσιωπημένη την HSP70. Παρατηρήθηκε ότι τα κύτταρα απέκτησαν έναν πιο μεσεγχυματικό φαινότυπο (κύτταρα ατρακτοειδή, απουσία διακυτταρικών συνδέσεων, πολύστοιβη ανάπτυξη), γεγονός που επιβεβαιώθηκε μοριακά, με ανοσοαποτύπωση κατά Western και ανοσοφθορισμό, από την απώλεια της ενδοθηλιακής πρωτεΐνης VE-καντερίνη και την έκφραση της μεσεγχυματικής πρωτεΐνης βιμεντίνη.Στο επόμενο μέρος της εργασίας μελετήθηκε ο ρόλος της HSP70 σε βασικές για την εξέλιξη των όγκων διαδικασίες, όπου παρατηρήθηκαν τα παρακάτω: Η απουσία της HSP70 δεν επηρεάζει τον ρυθμό ανάπτυξης των κυττάρων παρά μόνο σε συνθήκες πλήρους ταπητίου. Η απουσία της HSP70 αυξάνει τη μεταναστευτική ικανότητα των κυττάρων. Σε συνθήκες στρες όπως είναι η αυξημένη θερμοκρασία, η παρουσία χημειοθεραπευτικών ουσιών και η απουσία προσκόλλησης των κυττάρων (πρόκληση Anoikis απόπτωσης) η HSP70 προσδίδει ανθεκτικότητα στα κύτταρα με τον αντι-αποπτωτικό της ρόλο. Τα χημειοθεραπευτικά δοξορουβικίνη και cis-πλατίνη αυξάνουν τη μετανάστευση των κυττάρων, ενδεχομένως επάγοντας την ΕΜΤ.Εν συνεχεία προτείναμε ένα μοντέλο για την εμπλοκή των πρωτεϊνών β-κατενίνη και p53 στην Anoikis απόπτωση των κυττάρων σύμφωνα με το οποίο απουσία προσκόλλησης με την ECM και διακυτταρικών συνδέσεων η β-κατενίνη απελευθερώνεται από τα σύμπλοκα των διακυτταρικών συνδέσεων, στο κυτταρόπλασμα όπου συσσωρεύεται και ενεργοποιεί την p53. Η φωσφορυλιωμένη ενεργή p53 μεταβαίνει στον πυρήνα όπου, σύμφωνα με την βιβλιογραφία, επάγει τη μεταγραφή γονιδίων που σχετίζονται με την απόπτωση και στη συνέχεια η ενεργοποίηση αυτών των αποπτωτικών μονοπατιών καταλήγει στην ενεργοποίηση των κασπασών και την πρωτεόλυση της β-κατενίνης από αυτές.Τέλος επιβεβαιώθηκε η ετερογένεια των καρκινικών κυττάρων όσον αφορά την έκφραση επιθηλιακών και μεσεγχυματικών δεικτών και αποδείχθηκε ότι η απουσία της HSP70 οδηγεί στην απόκτηση ενός μεσεγχυματικού φαινοτύπου από τα κύτταρα (ΕΜΤ), με τρόπο ανεξάρτητο του WNT μονοπατιού.