Μελέτη μοριακών δεικτών βλαστικών κυττάρων στο γυναικολογικό καρκίνο

Abstract

The cancer stem cell hypothesis provides an attractive cellular mechanism to account for thetherapeutic refractoriness and the heterogeneity of most solid tumors. Cancer stem-like cells, the raresubpopulation of cells sustaining solid tumours, share important properties with pluripotent/multipotent stem cells. Both types of cells show self-renewal capacities, a variable potential formultilineage differentiation as well as invasiveness; thus, it has been suggested that a series ofembryonic genes, such as OCT4 and NANOG genes, may be reactivated or exhibit aberrant expressionpatterns in cancer.OCT4 and NANOG genes are precious transcription factors, involved in maintaining the stem andpluripotent states of a cell through transcriptional regulation; expression of these genes has previouslybeen demonstrated in various types of cancer and cancer cell lines. Importantly multiple OCT4- andNANOG- related pseudogenes have been identified, some of which are expressed in adult humantissues, while reporting on human “OCT4” as a stemness factor may be misleading; two isoforms, withdivergent biological functions, are generated by this gene. The actual stemness factor is OCT4A, whilethe other isoform, OCT4B, is a protein of as yet unknown function.The aim of this study is to validly investigate OCT4 isoforms and NANOG expression in ovarian andendometrial carcinomas. In parallel, we, indirectly, enquire into a putative role of OCT4B inoncogenesis; the minor allele (G) of the single nucleotide polymorphism rs3130932, locating in theOCT4B translation initiation codon, is expected to hamper OCT4B expression in homozygotesindividuals. A case–control association study was conducted for validating the GG genotype as a riskfactor for tumour development.Materials and Methods79 archival specimens were included in the gene expression study, namely 46 ovarian tumors (18serous borderline and 28 serous carcinomas), 24 endometrial carcinomas (10 grade I, 12 grade II and 2grade III) as well as 9 adjacent morphologically normal tissue areas (5 ovarian and 4 endometrial).Tissue microarrays (TMAs) were constructed and multiple cores (diameter 1.5mm) per tumor wereused. OCT4A/ OCT4B and NANOG expression was assessed on RNA that was extracted from TMAcore sections. Specific RT-PCR protocols were designed for the corresponding mRNA targets avoidingany known pseudogene matches. During standardization of the assays, a seminoma tumor was used ascontrol for OCT4A and NANOG, while peripheral blood mononuclear cell samples were used ascontrols for OCT4B. Anti-OCT4A (monoclonal, SC-5279) and anti-OCT4B (polyclonal, SC-25401)antibodies were used for immunohistochemical evaluation. Both cytoplasmic and nuclear positivity oftumor cells were evaluated and compared with normal tissue areas; focusing on OCT4A , sampleswere considered positive when there was medium and/or strong staining in >10% of tumor cells. Withregard to the case–control association study, blood samples were collected from 100 female patientswith, previously diagnosed, ovarian cancer and from 324 age-matched and sex-matched healthyindividuals. DNA was tested by restriction fragment length polymorphism-PCR for the presence ofrs3130932. Statistical association studies were carried out to investigate any associationbetween hOCT4 genotypes and the onset of cancer.ResultsRT-PCR study: OCT4A specific transcripts were detected in 29/70 cancerous samples as well as inone adjacent noncancerous tissue; this sample, although morphologically normal, adjoined to amalignant serous tumor. OCT4B specific transcripts were detected in 19 samples, distinctly cancerous.NANOG specific transcripts were detected in, almost, all the samples tested (cancerous andnoncancerous). Importantly OCT4A/ OCT4B/ NANOG specific transcripts were detected in very lowrelative amounts, as compared to endogenous controls.OCT4A and, especially, OCT4B transcripts were observed more often in ovarian than in endometrialtumors (p=0.0283 and p=0.0025, respectively).OCT4A and OCT4B mRNA expression correlated well with each other (p<0.0001) in the samplestested. Simultaneous OCT4A and OCT4B expression was not observed in normal samples but it wasstrongly associated with ovarian serous carcinomas (11/28 [39.3%], p=0.0044), while it was alsopresent in 3/18 (16.6%) ovarian borderline tumors and in 1/24 (4.2%) endometrial carcinomas, a gradeIII tumor.Immunohistochemistry study:Except for one serous carcinoma, 78/79 specimens tested were negativefor nuclear OCT4A. By contrast, cytoplasmic staining for OCT4B was observed in both cancerous and normal tissueelements in 76/79 cases. Nuclear positivity for OCT4B was observed in 15/46 ovarian, 6/24endometrial tumors and 3/9 adjacent noncancerous tissues.Case–control association study: Genotypic and allelic statistical analyses led to no significant case–control differences at a P value of less than 0.05 in ovarian cancer.ConclusionsLow OCT4A and OCT4B mRNA expression levels may be detected mainly in malignant ovariantumors and high grade endometrial carcinomas, reflecting the presence of a distinct cancer stem cellpopulation within the tumor. The simultaneous mRNA expression of both molecules seems to beassociated with the degree of malignancy. No correlation was observed between mRNA expression andimmunohistochemistry results. OCT4A protein was not detected in tumors expressing OCT4Atranscripts, likely, due to post-transcriptional/post-translational modifications. Importantly, sc-5279 andsc-25401 anti-OCT4 antibodies may, as well, detect pseudogene protein derivatives or OCT4-unrelatedpeptides, respectively.Low NANOG mRNA expression was detected in nearly all the samples examined, both cancerous andnon-cancerous. This intriguing expression pattern has recently been validated, reflecting the presenceof distinct, scarce populations of pluripotent stem cells in adult tissues and of cancer stem cells insomatic cancer, respectively. Of note, it was recently documented that stemness in human somaticcancer is mainly modulated via NANOGP8 protein, instead of the, previously considered, NANOG.The GG genotype in SNP rs3130932, hampering the expression of OCT4B-265 and OCT4B1 proteins,is not associated with increased/decreased ovarian cancer risk in individuals.

Σκοπός της παρούσης διατριβής ήταν η αξιόπιστη μελέτη έκφρασης των δύο εναλλακτικών ισομορφώντου γονιδίου OCT4 καθώς και του γονιδίου NANOG σε πρωτοπαθείς όγκους των ωοθηκών και τουενδομητρίου· έγινε προσπάθεια αναγνώρισης συσχέτισης μεταξύ της OCT4/ NANOG γονιδιακήςέκφρασης και της ιστολογικής διαβάθμισης των όγκων.Επιμέρους στόχο αποτέλεσε η διερεύνηση, εμμέσως, της πιθανής συμμετοχής της OCT4B-265πρωτεΐνης στη διεργασία της ογκογένεσης· οι ομοζυγώτες για το υπολειπόμενο αλλήλιο(G) τουπολυμορφισμού μονού νουκλεοτιδίου rs3130932 δεν δύνανται να εκφράσουν την OCT4B-265πρωτεΐνη. Πραγματοποιήθηκε μελέτη ασθενών-μαρτύρων επικεντρωμένη στην αναζήτηση τηςδύναμης συσχέτισης μεταξύ του GG γονότυπου και της σχετικής πιθανότητας ανάπτυξης ή μηκαρκίνου των ωοθηκών.Υλικά και ΜέθοδοιΣτη μελέτη έκφρασης των 2 ισομορφών του γονιδίου OCT4 και του γονιδίου NANOG περιελήφθησαν79, μονιμοποιημένα σε φορμόλη και εγκλεισμένα σε κύβους παραφίνης, αρχειακά δείγματα.Συγκεκριμένα, 46 πρωτοπαθείς επιθηλιακοί ορώδεις ωοθηκικοί όγκοι (28 κακοήθεις και 18 οριακήςκακοήθειας), 24 ενδομητριοειδή αδενοκαρκινώματα του ενδομητρίου (10 ΙΒΚ Ι, 12 ΙΒΚ ΙΙ, 2 ΙΒΚ ΙΙΙ)καθώς και 9 δείγματα από μοροφολογικά μη νεοπλασματικούς παρακείμενους ιστούς (5 ωοθηκικοί και4 ενδομητρίου). Κατασκευάστηκαν συνολικά 7 νέοι κύβοι παραφίνης που περιελάμβαναν, σεμικροσυστοιχίες (ΤΜΑ), ιστικούς κυλίνδρους από τα διαθέσιμα δείγματα (4 ΤΜΑ κύβοι για τους 46ορώδεις ωοθηκικούς όγκους και 3 ΤΜΑ κύβοι για τα 24 ενδομητριοειδή αδενοκαρκινώματα τουενδομητρίου). Ελήφθησαν τουλάχιστον 3 ιστικοί κύλινδροι ανά δείγμα, διαμέτρου 1.5 mm. Για τοσύνολο των δειγμάτων, η εκχύλιση RNA πραγματοποιήθηκε από τις τομές των μικροσυστοιχιών. Γιατις RT-PCR αντιδράσεις, σχεδιάστηκαν απολύτως ειδικοί ολιγονουκλεοτιδικοί εκκινητές. Ωςμάρτυρας για την ποιότητα του RNA και του αντίστοιχου cDNA, ενισχύθηκε τμήμα του μετάγραφουτου γονιδίου της β-ακτίνης. Για τις OCT4A και NANOG PCR αντιδράσεις ως θετικός εσωτερικόςμάρτυρας χρησιμοποιήθηκε RNA που εκχειλίστηκε από ιστικό τεμάχιο σεμινώματος όρχεως. Για τηνOCT4B PCR αντίδραση χρησιμοποιήθηκε RNA που εκχειλίστηκε από μονοκύτταρα περιφερικούαίματος. Εφαρμόστηκε ανοσοϊστοχημεία σε τομές πάχους 2 μm, που ελήφθησαν από τους TMAκύβους παραφίνης, με τη χρήση των αντισωμάτων sc-5279 (anti-OCT4A) και sc-25401 (anti-OCT4B).Αξιολογήθηκαν, επιμέρους, η κυτταροπλασματική και η πυρηνική ανοσοϊστοχημική θετικότητα. Όσοναφορά στην OCT4A πρωτεΐνη, ως θετικοί θεωρήθηκαν οι όγκοι με, τουλάχιστον ήπιας έντασης,πυρηνική θετικότητα σε ποσοστό άνω του 10% των νεοπλασματικών κυττάρων, ως προτείνεται από τιςπλέον έγκυρες δημοσιεύσεις.Στη μελέτη του πολυμορφισμού μονού νουκλεοτιδίου rs3130932 περιελήφθησαν 100 δείγματαπεριφερικού αίματος από γυναίκες στις οποίες είχε προηγουμένως διαγνωσθεί πρωτοπαθής όγκοςεπιφανειακού επιθηλίου-στρώματος ωοθηκών καθώς και 324 δείγματα περιφερικού αίματος απόενήλικες γυναίκες με ατομικό αναμνηστικό ελεύθερο για νεοπλασματική νόσο των ωοθηκών. Από ταδείγματα περιφερικού αίματος εκχειλίστηκε DNA και επακολούθησε μελέτη του πολυμορφισμούrs3130932 με ανάλυση του μήκους των περιοριστικών θραυσμάτων του PCR προϊόντος. Η δύναμη τηςσυσχέτισης μεταξύ της σχετικής πιθανότητας ανάπτυξης ή μη καρκίνου των ωοθηκών και τουγονοτύπου (TT/TG/GG) κατεδείχθει με τον υπολογισμό του λόγου πιθανοτήτων σχετικώνενδεχοµένων μετά 95% διαστημάτων εµπιστοσύνης.ΑποτελέσματαRT-PCR μελέτη: Από σύνολο 79 ιστολογικών παρασκευασμάτων, έκφραση mRNA της ισομορφήςOCT4A παρατηρήθηκε σε 28 νεοπλασματικά δείγματα καθώς και σε 1 μη νεοπλασματικό,παρακείμενο των όγκων, ιστό. Αξιοσημείωτο είναι το ότι το μη νεοπλασματικό δείγμα παρουσίαζεσημαίνουσα γειτνίαση με έναν κακοήθη ορώδη όγκο. Έκφραση mRNA της ισομορφής OCT4Βπαρατηρήθηκε σε 19 νεοπλασματικά δείγματα. NANOG γονιδιακή έκφραση παρατηρήθηκε, σχεδόν,επί του συνόλου των δειγμάτων της μελέτης και ανεξαρτήτως των ιστολογικών τους χαρακτηριστικών(όγκοι και μη νεοπλασματικοί, παρακείμενοι των όγκων, ιστοί). Χρήζει αναφοράς το ότι η έκφρασητων OCT4A/OCT4Β/ NANOG μεταγράφων στα δείγματα της μελέτης ήταν σημαντικά χαμηλότερησυγκρινόμενη με την αντίστοιχη των ενδογενών μαρτύρων γονιδιακής έκφρασης. Έκφραση mRNAτων ισομορφών OCT4A και OCT4B παρατηρήθηκε περισσότερο συχνά στα ωοθηκικά δείγματα έναντιτων δειγμάτων του ενδομητρίου (P value= 0.0283 και P value= 0.0025, αντιστοίχως).Η συσχέτιση της παράλληλης έκφρασης των 2 ισομορφών ανεδείχθη ως στατιστικά σημαντική (Pvalue= 0.0086). Ταυτόχρονη έκφραση mRNA των δύο ισομορφών παρατηρήθηκε σε 11 από τα 28 δείγματα κακοηθώνεπιθηλιακών ορωδών ωοθηκικών όγκων (39.3%), σε 3 από τα 18 δείγματα επιθηλιακών ορωδώνωοθηκικών όγκων οριακής κακοήθειας (16.67 %) καθώς και σε 1 ΙΒΚ III (4.17%) από τα 24 δείγματαενδομητριοειδών αδενοκαρκινωμάτων, ενώ δεν παρατηρήθηκε σε κανένα από τα 9 δείγματα μηνεοπλασματικών, παρακείμενων των όγκων, ιστών. Ως ιδίως σημαίνουσα θεωρήθηκε η ανάδειξηθετικής συσχέτισης για την παράλληλη έκφραση mRNA των ισομορφών OCT4A και OCT4Β στουςκακοήθεις επιθηλιακούς ορώδεις ωοθηκικούς όγκους (P value= 0.0044).Μελέτη Ανοσοϊστοχημείας:Μόνο 2 κακοήθεις επιθηλιακοί ορώδεις ωοθηκικοί όγκοι παρουσίασαν θετικότητα για την πρωτεΐνηOCT4A (πυρηνική και κυτταροπλασματική, αντιστοίχως).Κυτταροπλασματική θετικότητα για την πρωτεΐνη OCT4Β παρατηρήθηκε σε 76 από τα 79 διαθέσιμαδείγματα. Πυρηνική θετικότητα παρατηρήθηκε σε 15 από τους 46 πρωτοπαθείς επιθηλιακούς ορώδειςωοθηκικούς όγκους, σε 6 από τα 24 ενδομητριοειδή αδενοκαρκινώματα καθώς και σε 3 από τους 9 μηνεοπλασματικούς, παρακείμενων των όγκων, ιστούς.Μελέτη ασθενών-μαρτύρων:Δεν παρατηρήθηκε στατιστικώς σημαντική δύναμη συσχέτισης μεταξύ της σχετικής πιθανότηταςανάπτυξης ή μη καρκίνου των ωοθηκών και του GG γονότυπου.ΣυμπεράσματαΠαρατηρήθηκε χαμηλή σχετική έκφραση mRNA των OCT4A και OCT4B ισομορφών, κύρια σεκακοήθεις ωοθηκικούς όγκους καθώς και σε καρκινώματα ενδομητρίου υψηλού βαθμού ιστολογικήςκακοήθειας, η οποία αντανακλά, πιθανώς, την ύπαρξη εντός του όγκου ενός κυτταρικούυποπληθυσμού με χαρακτήρες πολυδύναμων βλαστικών κυττάρων. Η παράλληλη mRNA έκφρασητων δύο ισομορφών πιθανόν να συσχετίζεται με το βαθμό της ιστολογικής κακοήθειας.Τα αποτελέσματα της ανοσοϊστοχημείας βρέθηκαν να μην συνάδουν με τα αντίστοιχα αποτελέσματατης γονιδιακής έκφρασης. Δεν ανιχνεύτηκε ανοσοϊστοχημική πυρηνική θετικότητα για την OCT4Aπρωτεΐνη σε κανέναν από τους όγκους που παρουσίαζαν OCT4A γονιδιακή έκφραση· μη γνωστοί, έωςσήμερα, μοριακοί μηχανισμοί μετα-μεταγραφικής/ μετα-μεταφραστικής ρύθμισης, πιθανόν νααναστέλλουν την παραγωγή της OCT4A πρωτεΐνης. Αξιοσημείωτο είναι το ότι τα sc-5279 και sc-25401 αντι- OCT4 αντισώματα δυνατόν να ανιχνεύουν πεπτίδια που κωδικοποιούνται από τα OCT4ψευδογονίδια καθώς και πεπτίδια μη σχετιζόμενα με το γονίδιο OCT4,αντιστοίχως.Χαμηλή έκφραση NANOG mRNA έκφραση παρατηρήθηκε , σχεδόν, επί του συνόλου των δειγμάτωντης μελέτης, τόσο σε όγκους όσο και σε μη νεοπλασματικούς, παρακείμενων των όγκων, ιστούς. Το ωςάνω προφίλ έκφρασης τεκμηριώθηκε πρόσφατα στη διεθνή βιβλιογραφία. Χρήζει αναφοράς το ότιπρόσφατα κατεδείχθει πως κύριο ρυθμιστή του υψηλού δυναμικού αυτό-ανανέωσης και τηςπολυδυναμίας των καρκινικών βλαστικών κυττάρων συνιστά η πρωτεΐνη NANOGP8, αντί τηςNANOG ως πρότερα θεωρούνταν.Οι ομοζυγώτες για το υπολειπόμενο (G) αλλήλιο του SNP rs3130932 δεν παρουσιάζουν μεγαλύτερη ήμικρότερη σχετική πιθανότητα ανάπτυξης καρκίνου των ωοθηκών σε σχέση τόσο με τους ομοζυγώτεςγια το κυρίαρχο αλλήλιο (TT γονότυπος) όσο και με τους ετεροζυγώτες (TG γονότυπος). Οι OCT4B-265 και OCT4B1 πρωτεϊνικές ισομορφές, πιθανόν να μη μετέχουν στη διεργασία της ογκογένεσης.