Ο ρόλος των ενδοκανναβινοειδών στην αθηροσκλήρωση: πειραματική μελέτη

Abstract

Introduction: The newly discovered endocannabinoid system contributes tothe physiological regulation of energy balance, food intake and lipid and glucosemetabolism through both central and peripheral effects. The cannabinoids exerttheir pharmacologic action through the interaction with the specific receptors CB1and CB2, while the presence of another receptor is questionable (CB3). The formerreceptors are primarily distributed to the brain and adipose tissue but they are alsofound in the myocardium, vascular endothelium and sympathetic nerve terminals.Apart from their well-known psycho-active properties, novel data have risenconcerning the role of endocannabinoids in cardiovascular system. Underlyingmechanisms of cardiovascular cannabinoid actions may involve not only activationof cannabinoid receptors on peripheral nerves, but also signalling via receptorslocated in the vascular wall. Previous clinical trials reported that the CB1 receptorblocker, rimonabant, had significant effects on lipid parameters and severalcardiovascular risk factors. The influence of that antagonist on body composition,food consumption and metabolic agents has been recently investigated in rodentmodels and human beings. All data indicate a sustained weight loss and anincreased rate of smoking cessation. In particular central blockade decreases foodintake, while peripheral antagonism decreases abdominal fat, triglycerides, sd-LDL,CRP and insulin resistance. Besides this, CB1 receptor antagonist increasesremarkably HDL and adiponectin. Taken all together, it seems that CB1 receptorantagonist exerts multiple anti-atherogenic effects. Finally it remains unclearwhether receptor signalling via endocannabinoids regulates chronic subclinicalinflammation ongoing during atherosclerosis development. Now it’s essential toinvestigate the underlying mechanisms and the influence of these novelpharmaceutical compounds in the treatment of atherosclerosis.Aim: The aim of this study is to investigate the effects of a multi-factorialintervention of canabinnoid receptor antagonist and exercise program on anatherosclerotic animal model. For this purpose we used an animal model, prone toatherosclerosis, and we examined the pharmaceutical+exercise-induced changes inthe cellular and extracellular components, MMPs and TIMPs within theatherosclerotic plaque. Experimental design: Prospective, randomized, controlled, interventionalstudy.Setting: Center of Experimental Surgery, Foundation of BiomedicalResearch, Academy of Athens.Subjects: Male apoE-/- C57BL/6J knockout mice.Methods: At the age of 8 weeks, all mice were randomly assigned to thefollowing groups: a) Control group of atherosclerosis (Co, N=25), b) Exercisegroup (Ex, N=15), c) Rimonabant group (R, N=15), d) Rimonabant + Exercisegroup (REx, N=15). All groups were fed atherogenic, high-fat, diet for 16 weeksand at the end of the 16th week 10 male of Co group were euthanatized. Theremaining mice received normal, low-fat, diet for additional 6 weeks. During thistime period groups Ex and REx underwent an exercise-running program onmotorized treadmill (6weeks, 5days/week, 60min/session, 15m/min, 50), whilegroups R and Rex received the receptor antagonist SR141716 through oral gavageand the control group remained sedentary. At the end of the study all mice wereeuthanatized and the whole aorta from each mouse was excised and was blocked inparaffin for histological analysis. On the aortic sections we measured the lumenarea, the plaque area and the percentage of the aortic narrowing across the aorticarch. Using histochemical and immunohistochemical methods we calculated thepercentage of the atherosclerotic plaque with positive immunoreaction to ΜΜΡ-2,ΜΜΡ-3, ΜΜΡ-8, ΜΜΡ-9, ΤΙΜΡ-1 and ΤΙΜΡ-2. Finally blood sampling, in fastingstate (8 hours), was performed at the beginning and at the end of the study in orderto evaluate serum levels of glucose, total cholesterol, triglycerides, MMP-2, MMP-3, MMP-9 and TIMP-1.Results: The SR 141716 administration along with exercise program resultedin a considerable regression of atherosclerotic plaque burden, without changingbody weight, lipid parameters and glucose levels. Moreover the amount of collagen,elastin, TIMP-1 and TIMP-2 were significantly increased, while the concentrationsof macrophages, MMP-3, MMP-8 and MMP-9 within the atherosclerotic plaquewere considerably reduced. No marked differences between groups were detected insmooth muscle cells and MMP-2 relative area in the atherosclerotic lesions andarterial wall. Regarding serum levels of the above parameters our programmoderated the atherogenic diet-induced increment in MMP-3 and MMP-9 levels and triggered the elevation of TIMP-1 levels, following the changes at thehistological level.Conclusions: The performance of systemic, long-term SR 141716administration along with exercise program in animal model of atherosclerosisresults in the regression of atherosclerotic lesions and exerts beneficial effects onplaque composition and stability. The modification of MMPs and TIMPs modulatesthe above positive angio-protective effects of both intervention more than each onealone. Therefore, long-term combination of SR 141716 and exercise may be a firstlineintervention contributing to plaque stabilization and cardiovascular eventsprevention.

Εισαγωγή: Το ενδοκανναβινοειδές σύστημα που περιγράφηκε πρόσφατα,συμβάλει στη φυσιολογική ρύθμιση της ενεργειακής ισορροπίας, στην πρόσληψητροφής και στον μεταβολισμό λιπιδίων και της γλυκόζης μέσω κεντρικών καιπεριφερικών δράσεων. Τα κανναβινοειδή εξασκούν τις φαρμακολογικές τουςιδιότητες με τη δράση τους σε συγκεκριμένους υποδοχείς, τους CB1 και CB2, ενώ ηπαρουσία ενός επιπλέον υποδοχέα του CB3 αμφισβητείται. Οι υποδοχείς εντοπίζονταικυρίως στον εγκέφαλο, στο λιπώδη ιστό, στο μυοκάρδιο, στο ενδοθήλιο των αγγείωνκαι στους τελικούς συναπτικούς νευρώνες. Εκτός από τις γνωστές ψυχο-κινητικέςιδιότητες των ενδοκανναβινοειδών, νεότερα δεδομένα έχουν αυξήσει το ενδιαφέρονγια το ρόλο τους στο καρδιαγγειακό σύστημα.Η δράση των κανναβινοειδών στο καρδιαγγειακό σύστημα μπορεί ναεκδηλώνεται όχι μόνο με την ενεργοποίηση των κανναβινοειδών υποδοχέων σταπεριφερικά νεύρα , αλλά και με την αποστολή σήματος μέσω των υποδοχέων πουβρίσκονται στο αγγειακό τοίχωμα. Σε κλινικές έρευνες έχει αποδεχθεί ότι ηφαρμακευτική ουσία SR141716 (rimonabant), ένας αναστολέας των υποδοχέων CB1,έχει σημαντικές επιπτώσεις σε διάφορους καρδιαγγειακούς παράγοντες κινδύνου. Ηεπιρροή του ανταγωνιστή αυτού στην κατανομή λίπους στο σώμα, στη κατανάλωσητροφής και στους μεταβολικούς παράγοντες, έχει ερευνηθεί πρόσφατα σε κονίκλουςκαι σε ανθρώπους. Τα αποτελέσματα των μελετών αυτών αναφέρουν σημαντικήαπώλεια του σωματικού βάρους. Ειδικότερα, η δέσμευση των κεντρικών υποδοχέωνμειώνει την πρόσληψη φαγητού ενώ ο περιφερικός ανταγωνισμός μειώνει τοκοιλιακό λίπος, τα τριγλυκερίδια, των αριθμό των μικρών-πυκνών LDL (sd-LDL),την CRP και την αντίσταση στην ινσουλίνη. Εκτός αυτών, οι ανταγωνιστές των CB1υποδοχέων προκαλούν σημαντική αύξηση της υψηλής περιεκτικότηταςλιποπρωτείνης (HDL) και της λιπονεκτίνης, (adiponectin). Οι ανταγωνιστές,επομένως, του CB1 υποδοχέα, δυνατόν να έχουν πολλαπλή αντί-αθηρωσκληρωτικήδράση παραμένει, όμως ασαφές εάν η επικοινωνία των υποδοχέων μέσω τωνενδοκανναβινοειδών ρυθμίζει τη χρόνια υποκλινική φλεγμονή κατά τη διαδικασίατης αθηρογέννεσης.Σκοπός: Η παρούσα διδακτορική διατριβή στοχεύει να μελετήσει την πιθανήσχέση του ενδοκανναβινοειδούς συστήματος με την αθηρωματική νόσο με τη χρήση ζωικού προτύπου μελέτης και τη διερεύνηση των υποκείμενων μηχανισμών.Για το λόγο αυτό μελετήθηκαν οι αλλαγές, που μπορεί να επιφέρει η χορήγηση τουαναστολέα των ενδοκανναβινοειδών υποδοχεών CB1 με ή χωρίς παράλληληεκγύμναση των ζωικών προτύπων, στη συγκέντρωση των κυτταρικών στοιχείων,του εξωκυττάριου υλικού, των μεταλλοπρωτεϊνασών και των αναστολέων τουςστην αθηρωματική πλάκα.Πειραματικός σχεδιασμός: Προοπτική, τυχαιοποιημένη, ελεγχόμενη μελέτηπαρέμβασης.Τοποθεσία: Κέντρο Πειραματικής Χειρουργικής, Ίδρυμα ΙατροβιολογικώνΕρευνών Ακαδημίας Αθηνών.Πειραματόζωα: Αρσενικοί μύες με ομόζυγη έλλειψη της απολιποπρωτεϊνηςΕ (apoE-/- C57BL/6J knockout mice).Μέθοδος: Την 8η εβδομάδα ηλικίας τους οι μύες τυχαιοποιήθηκαν στιςπαρακάτω ομάδες: α) Ομάδα ελέγχου αθηρωμάτωσης (Control - Co, N=25)β)Ομάδα άσκησης (Exercise - Ex, N=15), γ) Ομάδα αναστολέα κανναβινοειδών(Rimonabant - R, N=15) δ) Ομάδα αναστολέα κανναβινοειδών και άσκηση(Rimonabant + Exercise - REx, N=15). Ακολούθησε σήμανση και αρίθμηση τωνμυών σε κάθε κλωβό, μέτρηση του σωματικού βάρους με τη βοήθεια ηλεκτρονικού ζυγούκαι λήψη μικρής ποσότητας αίματος από τρώση του οπισθοβολβικού πλέγματος, μετά από8ωρη νηστεία, για τον προσδιορισμό βιοχημικών παραμέτρων. Σε όλες τις ομάδεςχορηγήθηκε ειδική αθηρογόνος τροφή, με υψηλή περιεκτικότητα σε λιπαρά, για 16εβδομάδες. Στο τέλος της 16ης πειραματικής εβδομάδας έγινε ευθανασία σε 10 μυςτης ομάδας ελέγχου. Στους μυς όλων των ομάδων στη συνέχεια χορηγήθηκεφυσιολογική τροφή για επιπλέον διάστημα 6 εβδομάδων και παράλληλα οι ομάδεςEx και REx συμμετείχαν σε πρόγραμμα άσκησης-τρέξιμο σε μηχανικό κυλιόμενοτάπητα, ειδικό για μύες (5ημέρες/εβδομάδα, 60min/συνεδρία, 15m/min, 50), ενώστις ομάδες R και REx γινόταν χορήγηση, από το στόμα με καθετήρα, τουαναστολέα των υποδοχέων CB1. Στην ομάδα ελέγχου δεν υπήρξε κανένα ερέθισμα.Στο τέλος των 6 εβδομάδων ακολούθησε ευθανασία όλων των μυών. Μετά απόκάθε ευθανασία λαμβανόταν η αορτή των μυών και γινόταν εγκλεισμός τωνιστικών παρασκευασμάτων σε παραφίνη. Με την ιστολογική ανάλυσηπροσδιορίστηκαν το εμβαδό του αγγειακού αυλού, το εμβαδό των αθηρωματικώνπλακών και ο επί τοις εκατό βαθμός στένωσης του αυλού από τις αθηρωματικέςπλάκες κατά μήκος τους αορτικού τόξου. Επιπλέον με τη βοήθεια ιστοχημικών και ανοσοϊστοχημικών μεθόδων προσδιορίστηκε, σε διαφορετικές τομές κάθε φορά, τοποσοστό της επιφάνειας της αθηρωματικής πλάκας με θετική χρώση για τοκολλαγόνο, την ελαστίνη, τα μακροφάγα (αντιγόνο Mac-3), τα λεία μυϊκά κύτταρα(αντιγόνο α-actin), τη ΜΜΡ-2, τη ΜΜΡ-3, τη ΜΜΡ-8, τη ΜΜΡ-9, και τους ΤΙΜΡ-1, ΤΙΜΡ-2. Αιμοληψίες μετά από 8ωρη νηστεία έγιναν σε όλους τους μύες κατάτην έναρξη και τη λήξη της μελέτης και προσδιορίστηκαν τα επίπεδα της γλυκόζης,της ολικής χοληστερόλης, των τριγλυκεριδίων, της ΜΜΡ-2, της ΜΜΡ-3, τηςΜΜΡ-9 και του ΤΙΜΡ-1 στο αίμα.Αποτελέσματα: Παρά το γεγονός ότι η χορήγηση του αναστολέα τωνενδοκανναβινοειδών με παράλληλη άσκηση δεν οδήγησε σε στατιστικά σημαντικήμείωση του σωματικού βάρους, των λιπιδίων και της γλυκόζης του αίματος,εντούτοις είχε ως αποτέλεσμα την αξιοσημείωτη υποστροφή, μείωση του μεγέθους,της αθηρωματικής πλάκας. Η αλλαγή αυτή συνοδεύτηκε από αύξηση τουκολλαγόνου, της ελαστίνης, των ΤΙΜΡ-1 και ΤΙΜΡ-2 και μείωση της παρουσίαςτων μακροφάγων, της ΜΜΡ-3, της ΜΜΡ-8 και της ΜΜΡ-9 στην αθηρωματικήπλάκα. Αντίθετα στο τέλος της μελέτης η σχετική παρουσία των λείων μυϊκώνκυττάρων και της ΜΜΡ-2 στην αθηρωματική πλάκα παρέμειναν αμετάβλητα.Τέλος η συνδυασμένη παρέμβαση επιβράδυνε την αύξηση της συγκέντρωσης στοαίμα της ΜΜΡ-3 και της ΜΜΡ-9 και επέτεινε την αύξηση των επιπέδων του ΤΙΜΡ-1, γεγονός που ακολουθεί τα ιστολογικά αποτελέσματα.Συμπεράσματα: Η συστηματική, μακροχρόνια χορήγηση του αναστολέα τωνυποδοχέων CB1 του κανναβινοειδούς συστήματος παράλληλα με άσκηση φαίνεταινα έχει πλειοτροπική δράση στην υποστροφή της αθηρωματικής νόσου και σε μιασειρά από ποιοτικές μεταβολές στη σύστασή της, οδηγώντας σε μεγαλύτερησταθερότητα από ότι οι παρεμβάσεις αυτές ξεχωριστά. Επομένως ο παραπάνωσυνδυασμός αποτελεί μια πρώτης γραμμής θεραπευτική επιλογή για τησταθεροποίηση των αθηρωματικών αλλοιώσεων και την πρόληψη τωνκαρδιαγγειακών συμβαμάτων.