In vitro πολλαπλασιασμός και διαφοροποίηση ανθρώπινων εμβρυονικών βλαστικών κυττάρων

Abstract

The cells deriving from the early stages of human embryos are called human Embryonic Stem Cells (hESCs) and are characterized of the unique properties of pluripotency, self-renewal and high proliferative potential. Culturing hESCs under the effect of suitable growth factors cause them to differentiate into cell types originating from all three germ layers. Their plasticity makes them an important tool of studying differentiation in various tissues in vitro, with a future goal to be able to use these cells in cell-regenerative treatment of many chronic diseases. For the clinical use of these cells, however, it is necessary to develop safer and simpler production methods.Given the wide range of future applications of hESCs in clinical practice, our goal was to establish the methodology for culture and handling such cellular systems and thus the development and standardization of cultivation methods of hESCs and production of mature cells from them, originating from all three germ layers. At first we cultured the embryonic cancer cell line 2102Ep Cl.2 / A6 P48 (GlobalStem Inc.) in order to standardize the methods of cultivation. Then we studied the cell lines of human embryonic cells HUES-9p18 and HUES-7p15. A comparison of their proliferation potential, using as substrate mixture of extracellular matrix proteins (matrigel) and human mesenchymal stem cells (MSCs) revealed no statistically significant differences. We examined their ability to maintain their pluripotency in cultures by studying the expression of transcription factors Oct3 / 4, Nanog, Sox2, Rex-1 using the technique of RT-PCR and the expression of cell surface antigen SSEA-4 using flow cytometry.The differentiation of these cell lines to cell types of ectodermal (neural progenitor cells), mesodermal (progenitor haemapoetic cells and mesenchymal stromal cells) and endodermal (cells of difinitive endoderm) origin, by the use of suitable differentiative factors was successful. Greater efficiency was found at the differentiation to mesenchymal stromal cells and neural progenitor cells. The determination of the genetic stability of hESCs using the method of molecular karyotype (Agilent 1x244K και 4x180K CGH and SNPs arrays) revealed that both cell lines HUES-9 and HUES-7, have a normal karyotype (46XX and 46XY respectively) but show genetic instability (deletions and duplications) at the stages of undifferentiated cells and differentiated in mesenchymal and neural cells, as well. There was no characteristics of in vitro neoplastic transformation. All of the above indicate that random structural aberrations arise as a result of culture adaptation and do not affect the proliferative and differentiative potential of cells. Based on the results of this study a genetic screening of each cell population derived from differentiating hESCs cells is proposed.As part of this thesis, for the first time in Greece, we developed the methodology for culture and study of hESCs and we established effective methods of producing differentiated cells in order to be used in pre-clinical protocols.

Τα κύτταρα που προέρχονται από τα πρώιμα στάδια του ανθρώπινου εμβρύου ορίζονται ως Eμβρυονικά Βλαστικά κύτταρα (ΕΒΚ) και χαρακτηρίζονται από τις μοναδικές ιδιότητες της πολυδυναμίας, της αυτοανανέωσης και του υψηλού πολλαπλασιαστικού δυναμικού.Με την επίδραση κατάλληλων αυξητικών παραγόντων τα αΕΒΚ διαφοροποιούνται προς κυτταρικούς τύπους προερχόμενους και από τα τρία βλαστικά δέρματα. Η πλαστικότητα τους αυτή τα καθιστά ένα σημαντικό εργαλείο μελέτης της κυτταρικής διαφοροποίησης, σε ένα πλήθος ιστολογικών τύπων in vitro, με στόχο να μπορέσουν να χρησιμοποιηθούν στην κυτταρική-αναγεννητική θεραπεία πολλών χρόνιων νόσων. Ωστόσο, για την κλινική χρήση των κυττάρων αυτών απαραίτητη είναι η ανάπτυξη ασφαλέστερων και απλούστερων μεθόδων παραγωγής τους. Με δεδομένο το ευρύ φάσμα των εφαρμογών τους στην κλινική πράξη, σκοπός μας ήταν η ανάπτυξη κατάλληλων μεθόδων καλλιέργειας και η μελέτη του πολλαπλασιασμού και της διαφοροποίησής τους σε ιστούς προερχόμενους από τα τρία βλαστικά δέρματα με τη χρήση αυξητικών-διαφοροποιητικών παραγόντων. Αρχικά, καλλιεργήθηκε η εμβρυονική καρκινική κυτταρική σειρά 2102Ep Cl.2/A6 P48 (GlobalStem Inc.) προκειμένου να πραγματοποιηθεί αξιολόγηση των καλλιεργητικών υλικών και των παραγόντων πολλαπλασιασμού, με σκοπό την τυποποίηση των μεθόδων καλλιέργειας.Στη συνέχεια, μελετήθηκαν οι κυτταρικές σειρές αΕΒΚ HUES-9p18 και HUES-7p15. Αρχικά πραγματοποιήθηκε σύγκριση του πολλαπλασιαστικού δυναμικού τους, χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα στις καλλιέργειές μίγμα πρωτεϊνών εξωκυττάριας ουσίας, το matrigel και ανθρώπινα μεσεγχυματικά κύτταρα (ΜΣΚ) και δε παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές. Εξετάστηκε η διατήρηση της πολυδυναμίας τους κατά την καλλιέργεια με μελέτη της έκφρασης των μεταγραφικών παραγόντων Oct3/4, Nanog, Sox2, Rex-1 με την τεχνική RT-PCR, καθώς και της έκφρασης του επιφανειακού κυτταρικού αντιγόνου SSEA-4 με κυτταρομετρία ροής. Η διαφοροποίηση των κυτταρικών σειρών προς κυτταρικούς τύπους εξωδερμικής (προγονικά νευρικά κύτταρα, ΠΝΚ), μεσοδερμικής (προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα, ΠΑΚ και μεσεγχυματικά στρωματικά κύτταρα, ΜΣΚ) και ενδοδερμικής (κύτταρα καθορισμέμου ενδοδέρματος) προέλευσης, επιτεύχθηκε υπό την επίδραση κατάλληλων παραγόντων, με μεγαλύτερη απόδοση να εμφανίζει η διαφοροποίηση προς μεσεγχυματικά στρωματικά κύτταρα και προγονικά νευρικά κύτταρα. Ο προσδιορισμός της γενετικής σταθερότητα των κυττάρων με τη μέθοδο του μοριακού καρυοτύπου (Agilent 1x244K και 4x180K CGH και SNPs arrays) έδειξε ότι οι δύο κυτταρικές σειρές HUES-9 και HUES-7, έχουν φυσιολογικό καρυότυπο (46ΧΧ και 46 ΧΥ αντίστοιχα) αλλά παρουσιάζουν γενετική αστάθεια (ελλείψεις και διπλασιασμούς) τόσο στην αδιαφοροποίητη όσο και στην διαφοροποιημένη σε ΜΣΚ και ΠΝΚ μορφή τους. Δεν διαπιστώθηκαν in vitro χαρακτηριστικά νεοπλασματικής εξαλλαγής. Συμπερασματικά οι υποχρωμοσωμικές βλάβες προκύπτουν ως προσαρμογή των αΕΒΚ στην καλλιέργεια και δεν επηρεάζουν το πολλαπλασιαστικό και διαφοροποιητικό δυναμικό τους. Ωστόσο, προτείνεται ένας γενετικός έλεγχος (screening) κάθε κυτταρικού πληθυσμού που προέρχεται από διαφοροποίηση ΕΒΚ.Στα πλαίσια της διατριβής αυτής, για πρώτη φορά στην Ελλάδα, αναπτύχθηκε η τεχνολογία για την καλλιέργεια και μελέτη των αΕΒΚ και προτυπώθηκαν κατάλληλοι μεθόδοι παραγωγής διαφοροποιημένων κυττάρων για τη χρησιμοποίησή τους σε προ-κλινικά πρωτόκολλα.