Ο ρόλος του GH1 γονιδίου της αυξητικής ορμόνης και του υποκινητή του σε παιδιά με οικογενή μεμονωμένη ανεπάρκεια της αυξητικής ορμόνης

Abstract

Introduction: The physiological body growth requires a plethora of hormonal, metabolic, and other growth factors involved in the hypothalamo-pituitary-somatotrope axis. Growth hormone (GH), is a polypeptide hormone secreted from the anterior lobe of the pituitary gland and plays a pivotal role in a number of physiological processes by promoting postnatal longitudinal body growth, lipid and carbohydrate metabolism, protein biosynthesis and activation of the immune system. GH deficiency (GHD) is diagnosed either by subnormal levels of serum GH during two hGH stimulation tests by pharmacological agents that physiologically stimulate GH secretion (classic form of GHD), or normal serum GH levels, but subnormal 24hr GH profile (Neurosecretory GH deficiency, GHND). Children with GHD and GHND have severe growth retardation and respond to exogenous human GH (hGH) therapy with significant catch-up growth. Short stature associated with isolated GH deficiency (GHD) is both sporadic and idiopathic, but between 5 and 30% have an affected first degree relative consistent with a genetic etiology. Mutations identified on the GH gene (GH1) associate with the manifestation of familial isolated GH deficiency (IGHD). The GH1 gene, mapped to chromosome 17, is part of a GH gene cluster consisting of four other structural genes and is comprised by 5 exons and 5 introns. The proximal promoter region of GH1 exerts a highly polymorphic region, with at least 16 single nucleotide polymorphisms (SNPs) identified over a region of 535bp, manifested by a total of 40 haplotypes, some of which affect the GH1 expression. Aim: To identify possible changes in the sequence of the GH1 gene and its promoter region in patients with familial GH deficiency (GHD and GHND), that can possibly affect the transcription of GH1 and are involved in the pathogenesis of IGHD, together with the analysis of the inheritance pattern of such genetic changes. Patients and Methods: 33 IGHD patients (29 GHD και 4 GHND), their 1st degree relatives (22 families) and 31 controls were investigated. Genomic DNA was extracted from the lymphocytes of the subjects peripheral blood and the GH gene (GH1) was amplified by the Polymerase Chain Reaction (PCR). The samples were sequenced and the changes were identified according to the sequence M28466.1 of the NCBI blast database. In the patients full clinical history was recorded, along with other clinical characteristics such as bone age, growth velocity before and during hGH therapy, height and BMI SDS, whereas in the controls height and BMI SDS were recorded. Also in the patients, the levels of IGF-1 and other hormones of the pituitary were measured and the highest level of GH during the clonidine and L-Dopa hGH stimulation test were recorded, whereas in the 4 GHND patients with physiological levels of Hgh (>10ng/ml) during the stimulation tests a spontaneous 24hr GH profile was conducted. The sequencing results were analyzed for the frequencies of the genotypes of the identified SNPs and for any possible correlations with the clinical or biochemical characteristics of the patients and the controls, using the statistical program SPSS 20.0. Additionally, the possible functional role of the found mutations was assessed using specific programs. Results: The sequencing of GH1 and its promoter revealed 18 previously identified SNPs in the whole sample and 3 novel mutations in 3 of the 22 investigated families. Analysis with MatInspector of the 2 heterozygous nucleotide mutations located at the promoter regions -485GC and -400GA, respectively, revealed a binding sequence for the transcription factor E-twenty six-1 (ETS-1). These were identified in one GHD patient and its father and one GHND patient and its mother, respectively. The third heterozygous mutation (GA) at the +300 region of intron 1, was identified at the father but not the GHND patient of the family that had similar abnormal facial characteristics. Analysis of this mutation with ESEfinder3 and ASSP revealed a cryptic splicing position and disruption of the exon splicing enhancement (ESE) region by reducing the binding affinity of serine-arginine proteins (SRs). The frequency and correlation analysis showed that the GHD patients possible exert differential transcriptional activity at the GH1 gene via the SNPs at positions -278, -57 of the promoter, -6 of 5΄ UTR region, +1169 of intron 4, which is in accordance to previous studies, and also the newly reported SNP at -31 region. These SNPs associated also with decreased IGF-1 levels, especially SNP -57 that associated with decreased IGF-1 levels in the prepubertal GHD patients. Nevertheless, the -75 SNP did not seem to affect the expression of GH1. On the other hand, the SNPs identified in the GHND patients although similar to the GHD patients, they correlated with several growth parameters, like birth body length and weight, height and head circumference, irrespective to the IGF-1 levels. Conclusions: The 18 SNPs and 3 mutations identified in the sample seem to contribute partially and individually or in synergy to the transcriptional regulation of GH1 in the GHD and GHND patients. The SNPs contribution is differentially exerted in the GHD patients, when compared to the GHND patients and possibly reflects the different expression of the disease. The association of certain SNPs with the clinical and biochemical characteristics of the patients needs further investigation in large sample cohorts, whereas the changes identified in the study with a potential functional role, must be investigated in in vitro functional studies. The investigation of phenotypic variance in IGHD patients and their genetic predisposition can potentially improve our perception of the underlying mechanisms of growth and offer valuable information for the better therapeutic management of IGHD patients. Finally, while focusing on prediction models as well as ‘personalized’ growth-promoting therapy pharmacogenetics, pharmacogenomics and bioinformatics may play a major role in the future.

Εισαγωγή: Η φυσιολογική σωματική ανάπτυξη απαιτεί τη λειτουργία αρκετών ορμονικών, μεταβολικών, και άλλων αυξητικών παραγόντων που συμμετέχουν στον υποθαλαμο-υποφυσιακό-σωματοτροπικό άξονα. Η αυξητική ορμόνη (GH), πολυπεπτιδική ορμόνη που εκκρίνεται από τον πρόσθιο λοβό του αδένα της υπόφυσης, παίζει ιδιαίτερα σημαντικό ρόλο, καθώς προάγει κυρίως τη μεταγεννητική κατά μήκος αύξηση, και ελέγχει το μεταβολισμό των λιπιδίων και των υδατανθράκων, τη σύνθεση των πρωτεϊνών και τη διέγερση του ανοσοποιητικού συστήματος. Η ανεπάρκεια GH (GHD) διαγιγνώσκεται είτε με παθολογικές συγκεντρώσεις της GH στον ορό μετά από πρόκληση με φαρμακολογικούς παράγοντες που διεγείρουν την έκκριση της (κλασσική GHD), είτε με φυσιολογικές προκλητές δοκιμασίες αλλά παθολογικό 24ωρο εκκριτικό ρυθμό της GH (GH νευροεκκριτική δυσλειτουργία, GHND). Οι GHD και GHND ασθενείς έχουν σοβαρή καθυστέρηση αύξησης και ανταποκρίνονται καλά στην εξωγενή θεραπεία με hGH. Κοντό ανάστημα που σχετίζεται με ανεπάρκεια αυξητικής ορμόνης (GHD) μπορεί να είναι σποραδικού τύπου και ιδιοπαθής, αλλά στο 5-30% των περιπτώσεων υπάρχει προσβεβλημένος πρώτου βαθμού συγγενής, που υποδηλώνει γενετική αιτιολογία. Μεταλλάξεις του γονιδίου της GH (GH1) ευθύνονται για την εκδήλωση οικογενούς μεμονωμένης ανεπάρκειας GH (IGHD). Το GH1 γονίδιο, αποτελεί μέλος μιας ομάδας 5 γονιδίων, χαρτογραφείται στο χρωμόσωμα 17 και συνίσταται από 5 εξώνια και 4 εσώνια. Ο εγγύς υποκινητής του GH1 γονιδίου παρουσιάζει υψηλού βαθμού πολυμορφισμό, με τουλάχιστον 16 αναγνωρισμένους πολυμορφισμούς (SNPs) σε έκταση 535 βάσεων, που εκδηλώνονται σε σύνολο 40 απλότυπων, κάποιοι από τους οποίους επηρεάζουν την έκφραση της GH. Σκοπός: Η ανεύρεση αλλαγών στην αλληλουχία του GH1 γονιδίου και του εγγύς υποκινητή του σε ασθενείς με οικογενή μεμονωμένη ανεπάρκεια GH (GHD και GHND), που πιθανόν να επηρεάζουν την έκφραση του GH1 γονιδίου και την εκδήλωση του IGHD φαινότυπου, αλλά και η ανάλυση του τρόπου κληρονομικότητας αυτών των αλλαγών. Ασθενείς και μέθοδοι: Μελετήθηκαν 33 IGHD ασθενείς (29 GHD και 4 GHND), τα μέλη των οικογενειών τους (22 οικογένειες) και 31 μάρτυρες. Από τα άτομα αυτά απομονώθηκε γονιδιωματικό DNA από λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος και κατόπιν πραγματοποιήθηκε πολλαπλασιασμός του γονιδίου της GH (GH1) και του υποκινητή του με την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR). Τα δείγματα αλληλουχήθηκαν και στη συνέχεια προσδιορίστηκαν αλλαγές της αλληλουχίας με βάση την NCBI, blast- Μ28466.1 -βάση δεδομένων. Στους ασθενείς καταγράφηκαν τα σωματομετρικά χαρακτηριστικά γέννησης, το περιγεννητικό ιστορικό, ο κλινικός φαινότυπος, η οστική ηλικία, το ύψος SDS, το BMI SDS, η ταχύτητα αύξησης πριν και κατά τη διάρκεια της hGH αγωγής, και στους μάρτυρες το ύψος και BMI SDS. Επίσης, στους ασθενείς μετρήθηκαν τα επίπεδα IGF-1, τα επίπεδα των άλλων ορμονών του πρόσθιου λοβού του αδένα της υπόφυσης, η μέγιστη τιμή GH μετά από προκλητές δοκιμασίες με κλονιδίνη και L-Dopa, και στους 4 ασθενείς με φυσιολογικές προκλητές δοκιμασίες πραγματοποιήθηκε 24ωρη καταγραφή της αυθόρμητης έκκρισης της GH. Οι πολυμορφισμοί που ανιχνεύθηκαν στο GH1 γονίδιο και τον υποκινητή του σε ασθενείς και μάρτυρες, ελέγχθηκαν για τη συχνότητα των γονοτύπων τους, και συσχετίστηκαν με κλινικοεργαστηριακά χαρακτηριστικά, χρησιμοποιώντας το στατιστικό πακέτο SPSS 20.0, ενώ ο δυνητικός λειτουργικός ρόλος των μεταλλάξεων ελέγχθηκε με λογισμικά προγράμματα. Αποτελέσματα: Η αλληλούχιση του GH1 γονιδίου και του υποκινητή του ανέδειξε στον υπό μελέτη πληθυσμό 18 γνωστούς από τη βιβλιογραφία πολυμορφισμούς (SNPs) και τρεις μεταλλάξεις, που περιγράφονται για πρώτη φορά (novel), στις 3 από τις 22 οικογένειες που μελετήθηκαν. Ανάλυση με το λογισμικό πρόγραμμα MatΙinspector των 2 ετερόζυγων σημειακών μεταλλάξεων που εντοπίστηκαν στον GH1 υποκινητή, -485G>C and -400G>A, αποκάλυψε θέση πρόσδεσης για τον μεταγραφικό παράγοντα E-twenty six-1 (ETS-1). Οι μεταλλάξεις αυτές ανιχνεύτηκαν σε έναν GHD ασθενή και τον πατέρα του και σε μία GHND ασθενή και τη μητέρα της, αντίστοιχα. Η τρίτη ετερόζυγη μετάλλαξη (G>A) στη θέση +300 του εσωνίου 1 του GH1 γονιδίου, αναγνωρίσθηκε στον πατέρα αλλά όχι στον GHND ασθενή της οικογένειας, που είχε παρόμοια δυσμορφικά χαρακτηριστικά προσώπου. Ανάλυση αυτής της μετάλλαξης με τα λογισμικά προγράμματα ESEfinder3 και ASSP αποκάλυψε τη δημιουργία μιας κρυφή θέση ματίσματος και διάσπαση της περιοχής ματίσματος εξωνίου (ESE) ενός ψευδοεξωνίου, μειώνοντας τον αριθμό προσδενόμενων πρωτεϊνών πλούσιων σε σερίνη-αργινίνη (SR). Η στατιστική ανάλυση των συχνοτήτων των γονοτύπων στους πολυμορφισμούς υψηλής συχνότητας, και η συσχέτιση τους με παραμέτρους που σχετίζονται με την αύξηση, την έκκριση της GH, αλλά και την ανταπόκριση στην hGH αγωγή, έδειξε ότι οι GHD ασθενείς πιθανόν να εμφανίζουν διαφορετική μεταγραφική δραστηριότητα στο GH1 γονίδιο λόγω των θέσεων -278, -57 του υποκινητή, -6 της 5΄ UTR περιοχής και της θέσης +1169 του γονιδίου, που έρχεται σύμφωνο και με άλλες μελέτες, αλλά και της θέσης -31, που αναφέρεται για πρώτη φορά. Αυτοί οι πολυμορφισμοί συσχετίστηκαν με μειωμένα επίπεδα IGF-1, ιδίως ο -57 στους προεφηβικούς GHD ασθενείς. Ωστόσο, δεν φαίνεται να επηρεάζεται η έκφραση του GH1 γονιδίου από τον -75 πολυμορφισμό, όπως δείχνουν προηγούμενες μελέτες. Από την άλλη, οι SNPs που αναγνωρίσθηκαν στους GHND ασθενείς, παρόλο που είναι παρόμοιοι με αυτούς των GHD ασθενών, συσχετίστηκαν με παραμέτρους αύξησης, όπως βάρος και μήκος γέννησης, ύψος και περίμετρο κεφαλής, και όχι με τα επίπεδα IGF-1. Συμπεράσματα: Οι 18 πολυμορφισμοί και οι 3 μεταλλάξεις που ανιχνεύθηκαν στους GHD και GHND ασθενείς φαίνεται να συμβάλουν μερικώς και μεμονωμένα ή συνεργικά στη μεταγραφή και συνεπώς στην έκκριση της GH. Η διαφορετική συμμετοχή των SNPs στους GHD και GHND ασθενείς πιθανόν αντανακλά και τη διαφορετική εκδήλωση της νόσου. Οι συσχετίσεις των πολυμορφισμών με το ύψος ή άλλα φαινοτυπικά χαρακτηριστικά που πιθανόν επηρεάζουν την έκκριση GH, απαιτούν, ωστόσο, περαιτέρω διερεύνηση σε μεγαλύτερους πληθυσμούς, ενώ αλλαγές του γονιδιώματος με δυνητικά λειτουργικό ρόλο, πρέπει να εξεταστούν με in λειτουργικές μελέτες. Η κατανόηση της φαινοτυπικής ποικιλότητας των ασθενών με IGHD και των γενετικών αιτιών μπορεί να βοηθήσει στη κατανόηση των μηχανισμών που ενέχονται στον έλεγχο της αύξησης, αλλά και στη βελτίωση της παρακολούθησης και της θεραπεία των ασθενών. Τέλος, επικεντρώνοντας την προσοχή σε μοντέλα πρόβλεψης της αύξησης, καθώς επίσης και σε εξατομικευμένη θεραπεία προαγωγής της αύξησης, η φαρμακογενετική, η φαρμακογενωμική και η βιοπληροφορική φαίνεται ότι θα παίξουν καθοριστικό ρόλο στο μέλλον.