Μελέτη της ανάπτυξης των καρδιακών βαλβίδων χρησιμοποιώντας το zebrafish ως οργανισμό μοντέλο: η επίδραση γενετικών και φαρμακολογικών παραγόντων

Abstract

Ζebrafish is an excellent organism for modeling human diseases and is widely used for studies during the last two decades. It is amenable to forward and reverse genetic screens, and embryos can be obtained in large numbers, are transparent during early developmental stages. Most of the organs have simple morphology and are amenable to study at larval stages. During a forward genetic screen we identified two novel mutant lines. The first is the s457 line which we used as a model for studying intracardiac flow dynamics in respect to the development of the cardiac valves and the second one is the s266 line which is the first zebrafish CMT2D model. Here, we describe a novel zebrafish model of valve defects. We identified a novel mutant allele of southpaw, a nodal related gene involved in the early establishment of left-right asymmetry, which exhibits randomized heart and endoderm positioning. We show that unlooped hearts have defects in cardiac valve maturation, contrary to mutant hearts that are properly looped or exhibit situs inversus. spaw mutants have no detectable defects in myocardial function. Only the relative position of the two chambers is altered in these mutants, affecting the geometry of the heart and therefore the intracardiac flow pattern. We proved that that intracardiac flow dynamics regulate valve morphogenesis, independently of myocardial contractility.As mentioned above, in this study we also described the first Charcot-Marie-Tooth type 2D zebrafish model. CMT disease is a genetically heterogeneous group of peripheral neuropathies. Mutations in several aminoacyl tRNA synthetase genes have been implicated in inherited CMT disease. There are 12 reported CMT-causing mutations dispersed throughout the primary sequence of the human Glycyl t-RNA synthetase. While there is strong genetic evidence linking GARS mutations to CMT disease, the molecular pathology that underlies the progression of the neuromuscular phenotype is still not fully understood. During a forward genetic screen, we identified a zebrafish allele of gars. Homozygous mutant embryos carry a C->A transversion, leading to a non-conservative substitution within the gars gene that changes a threonine to a lysine. We show that the neuromuscular phenotype observed in animals homozygous for T130K is due to a loss of dimerization of the mutated protein and the loss of function and dimer deficient G240R mutant protein is unable to rescue the above phenotype. In addition, G526R Gars dimerizes with the remaining wild-type protein in animals heterozygous for the T130K GARS and reduces the function enough, to elicit a neuromuscular phenotype. Our data indicate that dimerization is required for the dominant neurotoxicity of disease-associated GARS mutations and provide a rapid, tractable model for studying newly identified variants for a role in human disease.

Το zebrafish έχει αναδειχθεί τις τελευταίες δεκαετίες σε σημαντικό πειραματικό μοντέλο των ανθρώπινων ασθενειών. Πολλοί είναι οι λόγοι που καθιστούν το zebrafish κατάλληλο ζωικό μοντέλο για ερευνητικούς σκοπούς σε πολλούς τομείς της επιστήμης. Χαρακτηριστικά αναφέρουμε την εξωτερική γονιμοποίηση και το γεγονός πως στα αρχικά στάδια ανάπτυξης τα έμβρυα παραμένουν διάφανα, ιδιότητα που μας δίνει τη δυνατότητα να μελετήσουμε in vivo την οργανογένεση χωρίς επεμβατικές τεχνικές, την υψηλή ομολογία με το ανθρώπινο γονιδίωμα, αλλά και το γεγονός πως μπορούν εύκολα να εφαρμοστούν πληθώρα μεθόδων πρόσθιας και ανάστροφης γενετικής. Στη παρούσα διδακτορική διατριβή περιγράφονται για πρώτη φορά δύο νέα μοντέλα zebrafish, η γενετική σειρά s457 που αποτελεί ένα νέο μοντέλο καρδιακής βαλβιδοπάθειας και η s266 γενετική σειρά που αποτελεί ένα νέο μοντέλο της πολυνευροπάθειας Charcot-Marie-Tooth τύπου 2D. Οι s457 και s266 οικογένειες προέκυψαν μετά από τυχαία μεταλλαξιγένεση με N-αίθυλ-N-νιτροουρία και επιλέχθηκαν με βάση την παλινδρόμηση του αίματος μεταξύ κόλπου και κοιλίας.Τα s457 ομόζυγα έμβρυα φέρουν μία σημειακή μετάλλαξη στο γονίδιο southpaw, στον οποίο η καρδιά παρουσιάζει είτε ετερόπλευρη θέση από το φυσιολογικό, είτε στη μέση γραμμή, είτε στη φυσιολογική κατά τυχαίο τρόπο ακολουθούμενη από τυχαία θέση των σπλαγχνικών οργάνων κατά την ανάπτυξης του ενδοδέρματος. Το southpaw σχετίζεται με το Nodal, γονίδιο το οποίο εμπλέκεται στην ρύθμιση της δεξιάς-αριστερής συμμετρίας. Διαπιστώσαμε ότι στα μεταλλαγμένα southpaw έμβρυα η σχετική θέση μεταξύ των δύο κοιλοτήτων αλλάζει, επηρεάζοντας την γεωμετρία της καρδιάς και αφήνοντας ανεπηρέαστη την μυοκαρδιακή λειτουργία. Σε συνδυασμό με τη μελέτη μιας άλλης γενετικής σειράς της s459 που φέρει μία σημειακή μετάλλαξη στο γονίδιο της βαριάς αλύσου της μυοσίνης του κόλπου, amhc ή myh6 και προκαλεί την ασυστολία του κόπου και βαλβιδοπάθεια στα ενήλικα μεταλλαγμένα ψάρια, αποδείξαμε ότι η αιμοδυναμική ροή εντός της καρδιακής κοιλότητας ρυθμίζει την μορφογένεση της κολποκοιλιακής βαλβίδας ανεξάρτητα από την μυοκαρδιακή συσταλτικότητα.Τα μεταλλαγμένα s266 έμβρυα φέρουν μία σημειακή μετάλλαξη στο gars γονίδιο, που προκαλεί την αντικατάσταση της φυσιολογικής θρεονίνης με μία λυσίνη στο αμινοξικό κατάλοιπο 209. Το Τ209 αμινοξύ είναι ιδιαίτερα συντηρημένο μεταξύ των ειδών και αντιστοιχεί στο ανθρώπινο κατάλοιπο 130. Τα ομόζυγα s266 έμβρυα εμφανίζουν μείωση των νευρομυϊκών συνάψεων στους αναπτυσσόμενους μυς, που οφείλεται στην απώλεια του διμερισμού της μεταλλαγμένης πρωτεΐνης. Επιπλέον, δείξαμε πως ο G319R Gars απώλειας της λειτουργίας ανθρώπινος αλληλόμορφος δεν διασώζει τον προαναφερθέντα νευρομυϊκό φαινότυπο. Τέλος, αποδεικνύουμε πως μία άλλη μετάλλαξη η G605R Gars που σχετίζεται με την εμφάνιση της ανθρώπινης ασθένειας, διμερίζεται με την εναπομείναντα αγρίου-τύπου πρωτεΐνη στα ετερόζυγα s266 ψάρια και μειώνει τη λειτουργία του ενζύμου τόσο ώστε να εμφανιστεί ο φαινότυπος. Τα αποτελέσματα μας υποδεικνύουν πως είναι απαραίτητος ο διμερισμός μεταξύ ενός μεταλλαγμένου μονομερούς με ένα αγρίου-τύπου μονομερές για τις αυτοσωμικές επικρατείς ασθένειες και πως το μοντέλο που προτείνουμε αποτελεί ένα νέο σημαντικό εργαλείο για τη μελέτη νέων μεταλλαγμένων ανθρωπίνων αλληλόμορφων.