Αποτελεσματικότητα και ασφάλεια χορήγησης της ριφαμπικίνης στην αντιμετώπιση της πειραματικής μόλυνσης του σκύλου με την Ehrlichia Canis

Abstract

Historically, tetracyclines are considered to be first-line drugs in the treatment of canine monocytic ehrlichiosis (CME) caused by Ehrlichia canis. However, only doxycycline has been critically evaluated in experimental or natural cases and current evidence implies that although doxycycline effectively ameliorates the E. canis-induced clinical and hematological abnormalities, it is not consistently effective in clearing the infection. In addition, some dogs may be intolerant to doxycycline,thus justifying the evaluation of medications that could be usedas alternatives to doxycycline. Recent data in a limited number of dog have indicated that rifampin may be effective in eliminating the infection in dogs experiencing the subclinical or chronic phase of the disease.There are currently no data on the potential effectiveness of rifampin in acute CME, while information on the potential adverse reactions of the drug in the dog is largely anecdotal.This study was undertaken to 1) evaluate the efficacy of rifampin in achieving clinical and hematological recovery and clearing the infection in dogs with experimental acute CME, 2) to compare the diagnostic sensitivity of three different tissues (blood, bone marrow, spleen) for the molecular (polymerase chain reaction, PCR) detection of E. canis DNA and 3) to investigate the potential clinical and clinicopathological abnormalities that may be associated with the dosing scheme selected in the current study.Sixteen Beagle dogs were enrolled in the study allocated into three groups. Group A (n=5) dogs were inoculated with the Israeli strain “611” of E. canis (propagated in DH82 cell culture) and treated with rifampin at 10mg/kg/24h, orally for 21 days (from 21-42 day post-inoculation, PID). All treated dogs were also given dexamethasone (0.5 mg/kgdexamethasone sodium, intravenously, once), 15 days after the completion of rifampin, to precipitate any latent E. canis infection. Group B (n=9) dogs were also inoculated with E. canisbut received no treatment (infected controls), while two dogs served as uninfected controls (Group C). For the duration of the study (terminated on 98 PID), the monitoring of the dogs was based on serial clinical examinations, complete blood counts, comprehensive serum biochemistry (including paired bile acid measurements), urinalysis, IgG-based indirect fluorescence antibody (IFA) testing and PCR for the detection of E. canis DNA in whole blood, bone marrow and splenic aspirates. Post inoculation, all infected dogs experienced clinical manifestations compatible with CME, whereas no difference was found in the median clinical score between infected treated and untreated dogs throughout the study. All infected dogs developed persistent thrombocytopenia until the 21PID. Treated dogs had significantly higher platelet counts compared to the infected untreated dogs on 42and 98 PID, whereas the time for normalization of the parameter appeared significantly shorter in the rifampin treated dogs compared to their infected untreated counterparts. All infected dogs seroconverted until the 21 PID, without significant difference between the two groups concerning the median value of the anti-E. canis IgG titre throughout the study. The DNA of E. canis was also detected in at least one tissue in all infected dogs by PCR by the 21 PID. On completion of the study, 3/5 and 6/9 dogs of the groups A and B, respectively, remained PCR positive. Bone marrow aspirates appeared to have the highest sensitivity compared to whole blood and spleenic tissue aspirates in determining the clearance status of the infection. The only appreciable clinical effect attributed to rifampin treatment was the discoloration of the urine, which appeared orange in all treated dogs treated during the entire treatment period, whereas the regimen used resulted in significantly increased concentration of serum bile acids and increased activity of alkaline phosphatase (ALP). In conclusion, rifampin, as used in this study, significantly hastened the resolutionof thrombocytopenia, but was inconsistent in eliminating the acute E. canisinfection. Urine discoloration, increased concentrations of serum bile acids and increased activity of ALP were the predominant clinical and clinicopathological abnormalities associated with rifampin treatment. Bone marrow appears to be of higher sensitivity for the PCR-based documentation of acute E. canis infection and clearing status of the infection may be optimized by molecular testing of an array of tissues (bone marrow, spleen and blood) at least 1-2 months post-treatment, so as to minimize the odds for obtaining false negative results.

Οι τετρακυκλίνες αποτελούν για δεκαετίες τα φάρμακα εκλογής για τη μονοκυτταρική ερλιχίωση του σκύλου (Ehrlichiacanis, ΜΕΣ). Ωστόσο, μόνο η δοξυκυκλίνη έχει μελετηθεί συστηματικά τόσο invitro, όσο και με κλινικές και πειραματικές μελέτες, τα αποτελέσματα των οποίων υποδηλώνουν πως η δοξυκυκλίνη είναι αποτελεσματική ως προς την επίτευξη κλινικής και αιματολογικής ίασης, ενώ αντίθετα, συχνά αποτυγχάνει να εκκριζώσει τη μόλυνση από τηνE.canis. Το γεγονός αυτό σε συνδυασμό με τη σχετικά συχνήεμφάνιση παρενεργειών κατά τη χρήση της, καθιστούν σκόπιμη την αναζήτηση καιαξιολόγηση εναλλακτικών φαρμακευτικών επιλογών.Στο παρελθόν, τα αποτελέσματα της αξιολόγησης άλλων φαρμακευτικών ουσιών όπως η διπροπιονική ιμιδοκάρβη, οι φθοριοκινολόνες και η αζιθρομυκίνη, δεν υπήρξαν ενθαρρυντικά. Πρόσφατες invitroαλλά και κλινικές μελέτες σε περιορισμένο αριθμό σκύλων έδειξαν πως η ριφαμπικίνη,ένα ημισυνθετικό παράγωγο της ριφαμυκίνης Β,μπορεί ενδεχομένως να αποτελέσει εναλλακτική φαρμακευτική αγωγή της δοξυκυκλίνης στη θεραπεία της ΜΕΣ, τόσο στο σκύλο, όσο και στον άνθρωπο. Οι στόχοι της παρούσας μελέτης ήταν 1) η διερεύνηση της αποτελεσματικότητας της ριφαμπικίνης στην επίτευξη κλινικής και αιματολογικής βελτίωσης και στην εκρίζωση της οξείας μόλυνσης από την E. canis, 2) η διερεύνηση των πιθανών κλινικών παρενεργειών και των αιματολογικών και βιοχημικών διαταραχών που σχετίζονται με τη χορήγηση της ριφαμπικίνης και 3)η σύγκριση της διαγνωστικής ευαισθησίας της PCRσε τρείς διαφορετικούς ιστούς (αίμα, μυελός των οστών και σπλήνας) στην ανίχνευση του DNA της E. canis στην οξεία ΜΕΣ.Στη μελέτη περιλήφθηκαν 16 σκύλοι φυλής Beagle, 7 αρσενικοί και 9 θηλυκοί, ηλικίας από 5-70 μηνών (διάμεση τιμή: 11 μήνες), οι οποίοι χωρίστηκαν σε τρεις ομάδες: Πέντε σκύλοι ενοφθαλμίστηκαν με την E. canisκαι ακολούθως έλαβαν θεραπεία με ριφαμπικίνη (ομάδα Α), 9 σκύλοι ενοφθαλμίστηκαν με την E. canisαλλά δεν έλαβαν θεραπεία (ομάδα Β, μολυσμένοι μάρτυρες), ενώ δύο σκύλοι δεν ενοφθαλμίστηκαν (ομάδα Γ, αρνητικοί μάρτυρες). Για τον ενοφθαλμισμό των σκύλων χρησιμοποιήθηκε το Ισραηλινό στέλεχος "611" της E. canis, το οποίο καλλιεργήθηκε και διατηρήθηκε σε κυτταροκαλλιέργεια DH82, με το οποίο μολύνθηκε ένα υγιές Beagle, το αίμα του οποίουχρησιμοποιήθηκε στη συνέχεια για τη μόλυνση των υπόλοιπων 13 σκύλων. Η θεραπεία των σκύλων της ομάδας Α περιελάμβανε τη χορήγηση ριφαμπικίνης στη δόση των 10mg/kg, από το στόμα, κάθε 24 ώρες, για 21 ημέρες. Η έναρξη της θεραπευτικής αγωγής έγινε την 21ηημέρα μετά τον ενοφθαλμισμό (ΗΜΕ), όταν όλα τα μολυσμένα ζώα πληρούσαν τα κριτήρια της οξείας ΜΕΣ και ολοκληρώθηκε την 42ηΗΜΕ. Επιπλέον, 15 ημέρες μετά την ολοκλήρωση της θεραπείας με τη ριφαμπικίνη, στα ζώα της ομάδας Α χορηγήθηκε νατριούχος δεξαμεθαζόνη σε δόση 0.5mg/kg, άπαξ, ως εναυσματικός παράγοντας για την πρόκληση υποτροπής πιθανής λανθάνουσας μόλυνσης από την E. canis. Κατά τη διάρκεια της μελέτηςκαι μέχρι την ολοκλήρωσή της (98η ΗΜΕ), τόσο για την επιβεβαίωση της μόλυνσης από την E. canis, όσο και για την μεταθεραπευτική παρακολούθηση, πραγματοποιούνταν τακτική κλινική εξέταση και βαθμονόμηση της κλινικής βαρύτητας της νόσου, γενική εξέταση αίματος, βιοχημικός έλεγχος στον ορό του αίματος, ο οποίος περιελάμβανε τον προσδιορισμό των ολικών πρωτεϊνών, των λευκωματινών, του ουρεϊκούαζώτου, της κρεατινίνης, της ολικής χολερυθρίνης, της αλανινοαμινοτρανφεράσης (ALT), της αλκαλικής φωσφατάσης (ALP), της γλυκόζης, του ολικού ασβεστίου, του φωσφόρου καθώς και μέτρηση της συγκέντρωσης των χολικών οξέων σε ζεύγη ορών, γενική ανάλυση ούρων, προσδιορισμός των ειδικών έναντι της E. canisIgG αντισωμάτων με τη μέθοδο του έμμεσου ανοσοφθορισμού (IFA) καιανίχνευση του 16SrDNA της E. canisσε δείγματα ολικού αίματος, μυελού των οστών και σπλήνα με δύο διαφορετικές τεχνικές PCR (nestedPCR και real-timePCR).Μετά την πειραματική μόλυνση και μέχρι την 21η ΗΜΕ, όλοιοι μολυσμένοι σκύλοι εμφάνισαν συμπτώματα συμβατά με τη ΜΕΣ, ενώ σε όλη τη διάρκεια της μελέτης δεν διαπιστώθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά ανάμεσα στις ομάδες Α και Β, ως προς την κλινική βαθμολόγησή τους. Μέχρι την 21η ΗΜΕ, όλοι οι μολυσμένοι σκύλοι εμφάνισαν θρομβοκυτταροπενία. Ο αριθμός των αιμοπεταλίων των σκύλων της ομάδας Α ήταν σημαντικά υψηλότερος αυτού της ομάδας Β κατά την 42η ΗΜΕ (ημέρα ολοκλήρωσης της θεραπευτικής αγωγής της ομάδας Α) (Wilcoxon-Mann-Whitney, p=0,0233)και την 98η ΗΜΕ (ημέρα ολοκλήρωσης της μελέτης) (Wilcoxon-Mann-Whitney, p=0,0195), ενώ η θρομβοκυτταροπενία αποκαταστάθηκε σημαντικά νωρίτερα στους σκύλους της ομάδας Α σε σχέση με αυτούς της ομάδας Β, κατά τη διάρκεια της χορήγησης της ριφαμπικίνης (καμπύλη Kaplan-Meier, p=0,048).Μέχρι την 21η ΗΜΕ, όλοι οι μολυσμένοι σκύλοι εμφάνισαν θετικό τίτλο IgG αντισωμάτων έναντι της E. canis και παρέμειναν οροθετικοί ως την ολοκλήρωση της μελέτης, χωρίς να διαπιστωθεί σημαντική διαφορά ως προς τα επίπεδα του τίτλου ανάμεσα στις δύο ομάδες σε όλη τη διάρκεια της μελέτης. Μέχρι την 21η ΗΜΕ (έναρξη της θεραπείας με ριφαμπικίνη), όλοι οι μολυσμένοι σκύλοι ήταν θετικοί στην PCR (τουλάχιστον σε έναν από τους εξεταζόμενους ιστούς και με τουλάχιστον μία από τις χρησιμοποιούμενες μεθόδους PCR). Κατά την ολοκλήρωση της μελέτης, 3/5 και 6/9 σκύλοι των ομάδων Α και Β, αντίστοιχα, εξακολουθούσαν να είναι θετικοί στην PCR σε έναν από τους ιστούς που εξετάστηκαν.Η διαγνωστική ευαισθησία διέφερε σημαντικά μεταξύ των ιστών που εξετάστηκαν (Cochran’sQtest,p=0,0014),με τον μυελό των οστών να εμφανίζει μεγαλύτερη ευαισθησία σε σχέση με την αντίστοιχη του ολικού αίματος(p=0,0035)ή του σπλήνα(p=0,0067). Σε επίπεδο εξεταζόμενου ιστού (ολικό αίμα, μυελός των οστών, σπλήνας), οι δύο μέθοδοι PCR εμφάνιζαν σημαντική συμφωνία σε ότι αφορά στο μυελό των οστών (Kappa=0,7004, p<0,0001), μέτριου βαθμού συμφωνία ως προς τα δείγματα σπληνικού ιστού(Kappa=0,4214, p=0,0006) και μικρή συμφωνία ως προς το ολικό αίμα(Kappa=0,2029, p=0,0191), ενώ σε επίπεδο σκύλου (ανεξάρτητα από τον εξεταζόμενο ιστό), διαπιστώθηκε μέτριο επίπεδο συμφωνίας μεταξύ τους (Kappa=0,4898, p<0,0001).Κατά τη διάρκεια της χορήγησης της ριφαμπικίνης στους σκύλους της ομάδας Α,η μοναδική κλινική διαταραχή που παρατηρήθηκεαφορούσε στην αλλαγή της χροιάς των ούρων, τα οποία ήταν πορτοκαλόχρωμα από την 1η ημέρα ως και ένα 24ωρο μετά τη διακοπή χορήγησης του αντιμικροβιακού. Η φαρμακευτική αγωγή δεν επηρέασε τη νεφρική λειτουργία, ενώ αντίθετα κατά τη διάρκεια της χορήγησης της ριφαμπικίνης οι σκύλοι της ομάδας Α παρουσίασαν σημαντικά αυξημένη δραστηριότητα της ALP,καθώς και αυξημένη συγκέντρωση των χολικών οξέων, χωρίς ωστόσο να επηρεαστεί η συγκέντρωση της ολικής χολερυθρίνης.Με βάση τα αποτελέσματα της μελέτης αυτής, 1) η ριφαμπικίνη, στο δοσολογικό σχήμα και στη διάρκεια που χορηγήθηκε, επιτάχυνε σημαντικά την αιματολογική ίαση (θρομβοκυτταροπενία), αλλά απέτυχε να εκριζώσει τη μόλυνση στους περισσότερους από τους σκύλους στους οποίους χορηγήθηκε, 2) Η ριφαμπικίνη, στο δοσολογικό σχήμα και στη διάρκεια που χορηγήθηκε στην παρούσα μελέτη, δεν οδήγησε σε αξιοσημείωτες κλινικές παρενέργειες ή σε αιματολογικές διαταραχές.Ωστόσο, οδήγησε στη σημαντική αύξηση της συγκέντρωσης των χολικών οξέων και της δραστηριότητας της αλκαλικής φωσφατάσης στον ορό του αίματος και 3) Η μοριακή εξέταση του υλικού από το μυελό των οστών φαίνεται να έχει σημαντικά μεγαλύτερη διαγνωστική ευαισθησία έναντι του αίματος και του υλικού από το σπλήνα για την εκτίμηση της εκρίζωσης της μόλυνσης από την E. canis στην οξεία ΜΕΣ. Για τη βελτιστοποίηση της αξιοπιστίας της μεταθεραπευτικής εκκρίζωσης της μόλυνσης, συνιστάται η μοριακή εξέταση συνδυασμού ιστών (μυελός των οστών, αίμα, σπλήνας) τουλάχιστον 1-2 μήνες μετά το πέρας της θεραπείας, ώστε να μειωθεί η πιθανότητα των ψευδώς αρνητικών αποτελεσμάτων.