Ανοσογενετική μελέτη ενδογενούς και εξωγενούς άσθματος

Abstract

Objective. Asthma is a common respiratory disease affecting more than 300 million individuals, whereas 250.000 deaths from asthma occur annually worldwide. In Greece the disease affects 5% of adults and 12% of children. The research has been focused lately on the genetic factors contributing to the development of asthma. This is the first study to investigate the IL‐1α, IL‐1β, IL1R, IL1RA, IL4, IL6, IL10, IL‐12, TNF‐ α, TGF‐β1 και IFN‐γ polymorphisms in asthmatic patients and their association with asthma and asthma severity in a greek population. Materials and methods. Thirty patients with allergic asthma, mean age 35.2±14.51 years (Group A) and 22 patients with non‐allergic asthma, mean age 47.1±16.3 years (Group B) were included in the study. All patients were recruited from the Asthma Clinic of Pulmonary Department, Aristotle University of Thessaloniki. 21 healthy control subjects, mean age 36.6±10.5 years were also included (Group C). All patients were subjected to skin prick tests, spirometry, methacholine challenge determination of total serum IgE and exhaled FeNO. For the immunogenetic study DNA was extracted from the patients’ peripheral blood samples. Determination of IL1α ‐889(T/C), IL1β‐511(T/C), IL1β+3962(C/T), IL1R1970(C/T), IL1RA mspa111100(C/T), IL‐2‐330 (T/G), IL2+166 (T/G), IL4‐1098(T/G), IL4‐590(C/T), IL4‐33(C/Τ), IL4RPOS‐1902, IL6‐174 (G/C), IL6nt565(A/G), IL10‐1082(G/A), IL10‐819 (C/T), IL10‐592 (C/A), IL12pos1188 (C/A), TNFα‐308(G/A), TNFα‐ 238(G/A), TGF‐β1codon10 (C/T), TGF‐β1 codon 25 (C/G), IFN‐γ+874 (Α/Τ) polymorphisms were performed by PCR using the INVITROGEN kit (C:cytokine, T:thymine, G:Guanine και A:Adenine). Results. Analysis of IL‐1 polymorphisms and in particular IL‐1β (+3962) showed statistically significant differences between Group A‐B (p=0.029) and Group B‐C (p=0.024) respectively. Furthermore, analysis for IL‐1 receptor (IL1R) showed statistically significant differences between Group B and C, where C/T showed an increased frequency in Group B and C/C in Group C (p=0.003). Besides, analysis of IL‐1 receptor antagonist (IL‐1RA) in C/T and Τ/Τ genotypes showed increased frequencies in Group A and C respectively (p=0.03). Analysis of IL4 ‐1098 polymorphisms showed an increased frequency of guanine in Group A (p=0.036) when compared to Group C whereas for IL4 –590, CC genotype showed an increased frequency in Group C and C/T in Group A (p=0.003), suggesting possible association between thymine and risk of asthma development. The IL6‐174 polymorphisms showed statistically significant differences between Group A‐B and Group B‐C άσθματος (p=0,004 και 0,019 respectively) where C/C showed an increased frequency in Group C. Regarding IL‐10 the diplotype GCC/ACC was more frequent in Group A when compared with Group (p=0,038). The TGF‐β1 diplotype CG/CC showed increased frequencies in comparison with Group B and Group C (p=0,041 και p=0,012 αντίστοιχα). Analysis of TNFα‐238 in G/G and A/G genotypes showed statistically significant differences between the Group A‐C, (p=0.008) and Group B‐C (p=0.001). G/G showed an increased frequency in Group C and A/G in Groups A and B. Besides, analysis of IFN‐γ showed that the AA genotype was associated with Group C whereas the genotype AT was associated with risk of development of endogenous asthma (p=0,006). Regarding asthma severity, severe asthma was when compared with mild asthma, associate with the genotype C/T of IL‐1α and IL1β+3962 (p=0.019 και p=0.025 respectively), with the IL‐4TTT/GCC diplotype, with the IL10GCC/ACC και IL10GCC/ATA diplotypes (p=0.045) and with the IL‐12AC genotype ((p=0.046). Conclusions. This is the first study to investigate cytokine gene polymorphisms in a Greek asthmatic population and one of the very few studies on interleukin polymorphisms in intrinsic asthma. Considerable results are presented. Interleukin polymorphisms showed significant differences between patients with extrinsic and intrinsic asthma and healthy control subjects, which are possibly associated with risk of asthma development and asthma severity.

Εισαγωγή: Το άσθμα αποτελεί μία συχνή νόσο καθώς αφορά 300 εκατομμύρια άτομα παγκοσμίως ενώ 250 χιλιάδες θάνατοι ετησίως αποδίδονται σε αυτό. Στην Ελλάδα η συχνότητα της νόσου πλησιάζει το 5% στους ενήλικες και το 12% στα παιδιά. Τα τελευταία χρόνια η έρευνα έχει στραφεί στο γενετικό υπόβαθρο της νόσου και στη μελέτη των γενετικών παραγόντων που σχετίζονται με την εμφάνισή της. Η παρούσα έρευνα αποτελεί μια πρώτη προσπάθεια μελέτης των πολυμορφισμών των IL‐1α, IL‐1β, IL1R, IL1RA, IL4, IL6, IL10, IL‐12, TNF‐α, TGF‐β1 και IFN‐γ και αναζήτησης συσχετίσεων με την εμφάνιση άσθματος και τη βαρύτητα της νόσου στον ελληνικό πληθυσμό. Υλικό‐μέθοδος: Στη μελέτη συμμετείχαν 30 ασθενείς με εξωγενές άσθμα, μέσης ηλικίας 35,2±14,51 έτη (Ομάδα Α, ΟΑ), 22 ασθενείς με ενδογενές άσθμα, μέσης ηλικίας 47,1±16,3 έτη (ΟΒ) που παρακολουθούνται στο Ιατρείο Άσθματος της Πνευμονολογικής Κλινικής του ΑΠΘ και 21 φυσιολογικά άτομα μέσης ηλικίας 36,6±10,5 έτη (ΟΓ). Οι ασθενείς υποβλήθηκαν σε σπιρομέτρηση, δερματικές δοκιμασίες, προσδιορισμό ολικής IgE του ορού, δοκιμασία μεταχολίνης και μέτρηση του εκπνεόμενου FeΝΟ. Για την ανοσογενετική μελέτη μετά από εξαγωγή του DNA από ολικό αίμα των ασθενών και εφαρμογή PCR με kit (INVITROGEN) αναζητήθηκαν οι πολυμορφισμοί των IL1α ‐889(T/C), IL1β‐511(T/C), IL1β+3962(C/T), IL1R1970(C/T), IL1RA mspa111100(C/T), IL‐2‐330 (T/G), IL2+166 (T/G), IL4‐1098(T/G), IL4‐590(C/T), IL4‐33(C/Τ), IL4RPOS‐1902, IL6‐174 (G/C), IL6nt565(A/G), IL10‐1082 (G/A), IL10‐819 (C/T), IL10‐592 (C/A), IL12pos1188 (C/A), TNFα‐308(G/A), TNFα‐ 238(G/A), TGF‐β1 κωδικόνιο10 (C/T), TGF‐β1 κωδικόνιο 25 (C/G), IFN‐γ+874 (Α/Τ) (όπου C κυτοσίνη, T θυμίνη, G γουανίνη και A αδενίνη). Αποτελέσματα: Στην οικογένεια της IL‐1 βρέθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των ομάδων Α‐Β και Β‐Γ στην IL1β στη θέση +3962 (p=0.029 και p=0.024 αντίστοιχα). Επιπλέον οι ομάδες Β και Γ διέφεραν σημαντικά στον υποδοχέα της IL‐1 (IL1R), καθώς στην ομάδα Β παρατηρήθηκε συχνότερα η ετεροζυγωτία C/T ενώ στην ΟΓ η ομοζυγωτία C/C (p=0.003). Επίσης στον ανταγωνιστή του υποδοχέα της IL1 στην ΟΑ εμφανίστηκε συχνότερα η C/T σε σχέση με την ΟΓ όπου υπερίσχυσε η Τ/Τ (p=0.03). Η IL4 ‐1098 στην ΟΑ εμφάνιζε συχνότερα γουανίνη (p=0.036) σε σχέση με την ΟΓ, ενώ στη θέση ‐590 στην ΟΓ εμφανίστηκε συχνότερα η C/C και στην ΟΑ η C/T (p=0.003), γεγονός που πιθανώς αποδίδεται σε αυξημένο κίνδυνο εμφάνισης της νόσου στα άτομα με θυμίνη στη συγκεκριμένη θέση. Όσον αφορά την IL‐6 οι γονότυποι στη θέση ‐174 βρέθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ της ομάδας ελέγχου και του ενδογενούς και εξωγενούς άσθματος (p=0,004 και 0,019 αντίστοιχα) καθώς η ομάδα ελέγχου εμφάνιζε συχνότερα την ομοζυγωτία CC. Οι διπλότυποι της ιντερλευκίνης 10 μεταξύ των ασθενών με εξωγενές και ενδογενές άσθμα διέφεραν στατιστικά σημαντικά (p=0,038). Ο διπλότυπος GCC/ACC βρίσκεται σε μεγαλύτερη συσχέτιση με την ομάδα των ασθενών με εξωγενές άσθμα. Όσον αφορά τον TGF‐β1 οι ασθενείς με εξωγενές άσθμα εμφάνιζαν σε μεγάλο ποσοστό τον διπλότυπο CG/CC σε σχέση με τους ασθενείς με ενδογενές και την ομάδα ελέγχου (p=0,041 και p=0,012 αντίστοιχα). Ο TNFα‐238 εμφάνισε διαφορές μεταξύ των ομάδων Α‐Γ και Β‐Γ (p=0.008 και 0.001 αντίστοιχα) καθώς στην ομάδα Γ βρέθηκε συχνότερα η G/G ενώ στις ομάδες Α και Β βρέθηκε συχνότερα η A/G. Στην IFN‐γ η ομάδα ελέγχου εμφάνιζε συχνότερα το γονότυπο AA ενώ το ενδογενές άσθμα τον ΑΤ (p=0,006). Όσο αφορά στη βαρύτητα της νόσου οι ασθενείς με βαρύ άσθμα εμφανίζουν σε σχέση με τους ασθενείς με ήπιο άσθμα στην IL‐1α και IL1β+3962 συχνότερα το γονότυπο CT (p=0.019 και p=0.025 αντίστοιχα), στην IL‐4 το διπλότυπο TTT/GCC (p=0.033), στην IL‐10 τους GCC/ACC και GCC/ATA (p=0.045) και στην IL‐12 τον γονότυπο AC ((p=0.046). Συμπεράσματα: Η παρούσα μελέτη αποτελεί την πρώτη προσπάθεια αναζήτησης πολυμορφισμών των ασθενών με άσθμα στην Ελλάδα και μία από τις ελάχιστες που ασχολείται με τους πολυμορφισμούς των ιντερλευκινών στο ενδογενές άσθμα. H μελέτη καταλήγει σε σημαντικά αποτελέσματα. Φαίνεται ότι οι πολυμορφισμοί των γονιδίων των ιντερλευκινών διαφέρουν μεταξύ των ατόμων με εξωγενές, ενδογενές άσθμα και της ομάδας ελέγχου και πιθανώς σχετίζονται με τον κίνδυνο εμφάνισης της νόσου ενώ σχετίζονται και με τη βαρύτητα της νόσου.