Μελέτη του ιού του ποικιλοχλωρωτικού νανισμού της μελιτζάνας (Eggplant mottled dwarf virus, EMDV)

Abstract

Eggplant mottled dwarf virus (EMDV) is classified in the genus Nucleorhabdovirus family Rhabdoviridae. Even though it is sporadically found since many years ago in cultivated, ornamental plants and weeds in the Mediterranean Basin, its genome sequence and organization were unknown. In the present study the complete nucleotide sequence of EMDV was determined employing a strategy that takes advantage of the virus untranslated conserved intergenic regions. The negative polarity, single-stranded RNA genome is 13,093 nucleotides long, and contains seven open reading frames (ORFs) organized in the order 3’ to 5’ which potentially encode a nucleocapsid (N), a X unknown protein, a phosphoprotein (P), a putative movement protein (Y), a matrix protein (M), a glycoprotein (G) and a polymerase (L). At the 3’ end of the genome, a leader sequence precedes the N gene, while at the 5' end of the genomic RNA, a terminal sequence, follows the L coding gene. Among the above genes, the size of each untranslated sequence ranges significantly, but all of them include a conserved intergenic region motif with a unique pattern characteristic of EMDV. Phylogenetic analysis of L (partial) confirmed the classification of EMDV in the genus Nucleorhabdovirus and demonstrated its close evolutionary relationship with PYDV. Furthermore, a quantitative real-time RT-PCR was developed for the accurate determination of the virus titre in host plants and minimization of the time needed for its diagnosis. Subsequently, four different total RNA extraction protocols were evaluated in order to highlight the one which shows the highest recovery. For this evaluation, synthetic EMDV RNA transcripts of known concentration were added in selected tissue from seven different plant species. The recovery rates of the synthetic transcripts and the effect of the presence of co-extracted inhibitors revealed two protocols being the more effective. The implementation of these protocols yielded no significant differences between the Ct values (the number of cycles required for the fluorescent signal to cross the threshold) of the recovered copies of the control and other plant extracts samples. Furthermore, the diagnostic specificity and sensitivity of the method were compared with those of the serological method DAS-ELISA. Thereafter, the genetic diversity and evolution of EMDV were studied. For this purpose new sequences corresponding to the N, X, P, Y, M, and a large part of the G gene were determined, from different isolates of EMDV, collected from Greece and Cyprus. The evolutionary relationships of these isolates were studied, based on the genetic variability of the determined sequences, maximum likelihood (ML) phylogeny, positive selection and recombination analysis. Phylogenetic analysis of all the gene regions strongly supported three distinct phylogenetic groups that appear to be related with the geographic origin of the isolates. Furthermore, the phylogenetic groups of the above isolates highlighted the significant role of insect vector and perennial host plants in their dispersion.

Ο ιός του ποικιλοχλωρωτικού νανισμού της μελιτζάνας (Eggplant mottled dwarf virus, EMDV) ανήκει στο γένος Nucleorhabdovirus της οικογένειας Rhabdoviridae. Παρόλο που απαντάται σποραδικά εδώ και πολλά χρόνια στη Μεσογειακή λεκάνη σε καλλιεργούμενα, καλλωπιστικά φυτά και αυτοφυή ζιζάνια, μέχρι σήμερα δεν είχε προσδιοριστεί η νουκλεοτιδική αλληλουχία και η οργάνωση του γονιδιώματος του. Στην παρούσα διατριβή, προσδιορίστηκε για πρώτη φορά το γονιδίωμα μιας απομόνωσης του EMDV, με μία νέα στρατηγική που χρησιμοποιεί τις εξαιρετικά συντηρημένες, μεταξύ των γονιδίων, περιοχές του ιού. Το αρνητικής πολικότητας, μονόκλωνο RNA γονιδίωμα του EMDV είναι μήκους 13.093 νουκλεοτιδίων και περιέχει 7 ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης (ΑΠΑ) τα οποία οργανώνονται σε κατεύθυνση 3' προς 5' και δυνητικά κωδικοποιούν επτά πρωτεΐνες, την Νουκλεοπρωτεΐνη Ν, την Χ άγνωστης λειτουργίας πρωτεΐνη, την Φωσφοπρωτεΐνη Ρ, την υποθετική πρωτεΐνη διακυτταρικής μετακίνησης Υ, την Βασική πρωτεΐνη περιβλήματος Μ, την Γλυκοπρωτεΐνη G και την Πολυμεράση L. Στο 3' άκρο της αλληλουχίας αυτής, η αλληλουχία οδηγός, προηγείται του γονιδίου της Νουκλεοπρωτεΐνης Ν, ενώ στο 5' άκρο του γονιδιωματικού RNA, η μετατερματική αλληλουχία, έπεται του γονιδίου της Πολυμεράσης L. Μεταξύ των γονιδίων, το μέγεθος των αμετάφραστων περιοχών παραλλάσει σημαντικά, με σταθερή την παρουσία μιας ελαχίστων νουκλεοτιδίων συντηρημένης αλληλουχίας που το μοναδικό της μοτίβο χαρακτηρίζει τον ιό EMDV. Η φυλογενετική ανάλυση μεγάλου τμήματος της πρωτεΐνης L επιβεβαίωσε την κατάταξη του EMDV στο γένος Nucleorhabdovirus και απέδειξε την στενή εξελικτική σχέση του με τον PYDV. Περαιτέρω, αναπτύχθηκε μοριακή δοκιμή, ποσοτικής, πραγματικού χρόνου RT-PCR για τον ακριβή προσδιορισμό του ιικού φορτίου σε φυτά-ξενιστές του EMDV, καθώς και την ελαχιστοποίηση του χρόνου διάγνωσης. Κατόπιν, αξιολογήθηκαν τέσσερα διαφορετικά πρωτόκολλα εκχύλισης ολικού RNA με σκοπό την ανάδειξη αυτού με την υψηλότερη ανάκτηση ιικού φορτίου. Για την αξιολόγηση αυτή, επιλέχθηκε ιστός από επτά διαφορετικά φυτικά είδη, στους οποίους και προστέθηκαν συνθετικά αντίγραφα RNA του EMDV γνωστής συγκέντρωσης. Τα ποσοστά ανάκτησης των συνθετικών αντιγράφων και ο έλεγχος της επίδρασης της παρουσίας συνεκχυλισθέντων αναστολέων στην απόδοση της δοκιμής, ανέδειξαν ως επικρατέστερα δύο πρωτόκολλα. Η εφαρμογή των πρωτοκόλλων αυτών έδωσε μη στατιστικά σημαντικές διαφορές μεταξύ των τιμών Ct (ο κύκλος κατά τον οποίο οι τιμές φθορισμού της PCR υπερβαίνουν την ουδό ανίχνευσης του προϊόντος) των ανακτώμενων αντιγράφων του μάρτυρα και των υπολοίπων φυτικών εκχυλισμάτων. Παράλληλα, αξιολογήθηκε η διαγνωστική εξειδίκευση και ευαισθησία της δοκιμής σε σχέση με την ορολογική δοκιμή DAS-ELISA. Ακολούθως, μελετήθηκε η γενετική παραλλακτικότητα και εξέλιξη του ιού. Για το σκοπό αυτό προσδιορίστηκαν οι αλληλουχίες των γονιδίων Ν, Χ, Ρ, Υ, Μ και G, οχτώ απομονώσεων του ιού από διάφορους ξενιστές που συλλέχθηκαν από την Ελλάδα και την Κύπρο. Μελετήθηκαν οι εξελικτικές τους σχέσεις με τη βοήθεια αναλύσεων γενετικής παραλλακτικότητας των προσδιορισθέντων αλληλουχιών, προσδιορισμού ανασυνδυασμών, θετικής επιλογής και κατασκευή φυλογενετικών δέντρων με τη μέθοδο μέγιστης πιθανοφάνειας (Maximum Likelihood, ML). Η φυλογενετική ανάλυση των περιοχών αυτών κατέταξε τις απομονώσεις σε τρεις διακριτούς κλάδους με κοινή τοπολογία σε όλα τα γονίδια, που φαίνεται να επηρεάζεται σημαντικά από την γεωγραφική προέλευση των απομονώσεων. Παράλληλα, η ομαδοποίηση των απομονώσεων που πρόκυψε, ανέδειξε τη σημασία της παρουσίας του εντόμου-φορέα και των αγενώς πολλαπλασιαζόμενων πολυετών φυτών-ξενιστών στη διασπορά τους.