Ανάπτυξη αντικαρκινικών μορίων με δράση αναστολής των πρωτεϊνικών φωσφατασών 1 και 2Α κει ειδικότητα στόχευσης καρκινικών όγκων που εκφράζουν μεμβρανικούς διακομιστές οργανικών ανιόντων, πάνω στη βάση της δομής της μικροκυστίνης LR

Abstract

Background:Microcystins and Nodularins are natural cyclopeptides synthesized from cyanobacteria and areconsidered health hazardous due to their toxic effects after acute consumption or chronic exposure.From a pharmacologic point of view, microcystins are stable, hydrophilic cyclic heptapeptides with theability to cause extensive cell damage uptaken intracellularly through Organic Anion TransportingPolypeptides (OATP) Their main endocellular biological mechanisms of toxicity is the inhibition of theprotein phosphatases PP 1 and 2A, the reduction of Glutathione levels and the increase of theReactive Oxygen Species (ROS) concentration. This research focused on investigation of microcystinsas potential anticancer compounds to target cancers that express OATPs.Methods:We used the polyclonic p1A2 and p1B3 as well as the monoclonic antibodies mESL and mMDQ for (a)immunohistochemistry on human paraffien empedded tissue samples and (b) Western blotting on freshfrozen tissue and cell lines. Furthrmore we used the following characterized cancer and normal celllines: MIA PaCa-2, Bx-PC3, MRC-5, HepG2, CaCo-2, CHO (1Β1, 1Β3 transfected) as well as humanprimary peripheral monocytes. The endogenous expression of OATPs was assessed by real time PCR.xCELLigence and flow cytometry (Annexin/PI) methods were used for the study of microcystin-LR celltoxicity. Modeller 9.11 software was used for the in silico design and calculation of the structure ofOATPs, microcystin/NAC molecules as well as their probable interactions. Graphs, statistical analysisand IC50 calculations were assessed by GraphPad Prism and xCELLigence software respectively. Results:The data resulted from our experimental procedures confirm the expression of OATPs in humannormal liver tissue and proove the intense and abundunt expresison of OATP1B3 in many cancerssuch as breast, lung, pancreas, colon, stomach as well as in the cencer cell lines Bx-PC3 and MIAPaCa-2. Moreover, OATP1B3 shows a time-depentend expresison profile in these two cell lines. Ofgreat interest, the epigenetic regulation of expression of OATP1B3 observed in the HepG2 cell line,appears to be absent in Bx-PC3 and MIA PaCa-2 lines. In addition the two pancreatic cancer cell linesshowed a relative sensitivity to microcystin-LR, proportional to the OATP1B3 expression level. Ofinterest, microcystin LR surpassed the toxic effect of the chemotherapeutic agent gemcitabine in theBx-PC3 cell line. The initial hypothesis of the cytoprotective ability of N-acetylcystein was confirmed, asNAC managed to reduce the cytotoxic rate caused by microcystin-LR exposure in normal and not incancer cell lines. Regardless the multiple attempts for the in vitro synthesis of a stable MC-LR/NACcomplex molecule this was not made possible.Conlusions:The expression of OATPs 1A2, 1B1 and 1B3 in cancer tissues makes them candidate therapeutictargets. We propose that structural modification of the MC-LR molecule could result in the developmentof novel compounds with activity against pancreatic cancers that express OATP1B3.

Υπόβαθρο:Τα κυκλοπεπτιδικά µόρια που συντίθενται απο τα κυανοβακτήρια, συµπεριλαµβανοµένων τωνµικροκυστνών και των νοντουλαρινών, θεωρούνται επικίνδυνα για την ανθρώπινη υγεία λόγω τωνπιθανών τοξικών επιδράσεων µετά απο µεγάλη κατανάλωση ή µακροχρόνια έκθεση. Ωστόσο, οιµικροκυστίνες λόγω φυσικοχηµικών ιδιοτήτων και της δυνατότητας να προκαλούν κυτταρική βλάβηµετά από πρόσληψη µέσω συγκεκριµένων µεµβρανικών διακοµιστών των Πολυπεπτιδίων ΜεταφοράςΟργανικών Ανιόντων (OATPs), παρουσιάζουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον από φαρµακολογικής πλευράς.Κυριότερες ενδοκυττάριες δράσεις τους είναι η αναστολή των καταλυτικών υποµονάδων τωνΠρωτεϊνικών Φωσφατασών 1 (PP1) και 2Α (PP2Α), η µείωση των επιπέδων γλουταθειόνης (GSH) καιη αύξηση των ελευθέρων ριζών οξυγόνου (ROS). Στην βάση αυτή µελετήθηκαν στην παρούσαδιατριβή ως δυνητικά νέα αντικαρκινικά µόρια µε στόχευση καρκίνους που εκφράζουν OATPsΜέθοδοι:Για τη µελέτη έκφρασης των Πολυπεπτιδίων Μεταφοράς Οργανικών Ανιόντων χρησιµοποιήθηκαν ταπολυκλωνικά αντισώµατα p1A2 και p1Β3 καθώς και τα µονοκλονικά mESL και mMDQ µε τις µεθόδους(α) της ανοσοϊστοχηµείας για ανθρώπινο ιστό εγκλείσµένο σε παραφίνη και (β) Western Blotαποτύπωσης για ανθρώπινο φρέσκο κατεψυγµένο ιστό και κυτταρικές σειρές. Χρησιµοποιήθηκαν οιχαρακτηρισµένες καρκινικές και φυσιολογικές σειρές: MIA PaCa-2, Bx-PC3, MRC-5, HepG2, CaCo-2,CHO (1Β1, 1Β3 επιµολυσµένα) καθώς και πρωτογενείς ανθρώπινες κυτταρικές καλλιέργειες αποπεριφερικά µονοκύτταρα αίµατος. Η µελέτη έκφρασης των διακοµιστών σε επίπεδο mRNA έγινε µε realtime PCR. Ο έλεγχος της τοξικότητας της µικροκυστίνης σε κυτταρικά µοντέλα in vitro έγινε µε τοσύστηµα xCELLigence (σε πραγµατικό χρόνο) και µε τη µέθοδο της κυτταροµετρίας ροής (Annexin/PI).O in silico λογικός σχεδιασµός της δοµής των διακοµιστών, της µικροκυστίνης και του MC-LR/NACµορίου και οι ανάλογες αλληλεπιδράσεις έγιναν µε το λογισµικό Modeller 9.11. Τα γραφήµατα, ηστατιστική ανάλυση των δεδοµένων και ο υπολογιµός των τιµών IC50 έγινε µε τα λογισµικά GraphPadκαι xCELLigence αντίστοιχα. Αποτελέσµατα:Τα δεδοµένα που προέκυψαν απο την παρούσα ερευνητική εργασία, αρχικά επιβεβαιώνουν τηνέκφραση των διακοµιστών OATP σε ανθρώπινο φυσιολογικό ηπατικό ιστό και επιπλέον αποδεικνύουντην έντονη έκφραση του OATP1B3 σε καρκινικούς ιστούς µαστού, πνεύµονα, παγκρέατος, εντέρου καιστοµάχου αλλά και στις κυτταρικές σειρές BxPC-3 και MIA PaCa-2. Στα εν λόγω κυτταρικά µοντέλα οOATP1B3 ακολουθεί χρονοεξαρτώµενη έκφραση µε το µέγιστο της να εντοπίζεται στα αρχικά στάδιατης καλλιέργειας. Απουσιάζει επιγενετικός µηχανισµός ρύθµισης της έκφρασης του 1Β3 στις κυτταρικέςσειρές BxPC-3 και MIA PaCa-2 αλλά φαίνεται οτι υπάρχει στη κυτταρική σειρά HepG2. Οι κυτταρικέςσειρές που εκφράζουν τον OATP1B3, εµφανίζουν ιδιαίτερη ευαισθησία στη µικροκυστίνη-LR αναλογικήµε τα επίπεδα έκφρασης του διακοµιστή. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον προκαλεί η παρατήρηση ότι η σειρά BxPC3παρουσιάζεται περισσότερο ευαίσθητη στη µικροκυστίνη παρά στη gemcitabine πουχρησιµοποιείται στη θεραπεία του µεταστατικού-προχωρηµένου καρκίνου του παγκρέατος. Η αρχικήυπόθεση περι της ικανότητας της ακετυλοκυστεΐνης να διαφυλάττει τη βιωσιµότητα των φυσιολογικώνέναντι των καρκινικών κυττάρων επιβεβαιώθηκε έµµεσα όταν η NAC χρησιµοποιηθείσα πρίν τηνέκθεση σε MC-LR κατάφερε να ελαττώσει το ρυθµό µεταβολής της προκαλούµενης τοξικότητας αποτην µικροκυστίνη στα κύτταρα ελέγχου CHO. Παρά τις αλλεπάλληλες προσπάθειες για την in vitroσύζευξη την MC-LR µε τη NAC, αυτό δεν κατέστη δυνατόν.Συµπεράσµατα:Η επιβεβαιωµένη έκφραση των OATPs 1Α2, 1Β1 και 1Β3 σε καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση µεφυσιολογικούς, τους καθιστά υποψήφιους στόχους για τη θεραπευτική εκµετάλλευση και αξιοποίησητους. Στην εποχή της στοχευµένης θεραπείας του καρκίνου, οι κυανοτoξίνες αποτελούν µια πλούσιαπηγή φυσικών κυτταροτοξικών ενώσεων µε δυνατότητα στόχευσης καρκίνων που εκφράζουνσυγκεκριµένους πρωτεϊνικούς διακοµιστές πρόσληψης. Eπιπλέον προσπάθεια αξίζει να καταβληθεί γιατη σύζευξη και σύνθεση σταθερού σύµπλοκου MC-LR/NAC ώστε να ενισχύσει το θεραπευτικό δείκτηκαι να ελαττώσει πιθανά προβλήµατα τοξικότητας οργάνων στόχων.